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Introducción

Recientemente, el campo de los biomateriales se ha concentrado en el desarrollo de materiales que no sólo sean bionertes, si no que sean capaces de interactuar de manera específica con el entorno biológico donde se encuentren. Las investigaciones de biomateriales se han enfocado cada vez más en estudiar la relación específica entre las propiedades físico-químicas de los materiales y las proteínas, enzimas o moléculas biológicas; así como en observar las funciones celulares y determinar los parámetros fisiológicos requeridos (WEIYUAN, 2002). De allí que las nuevas tecnologías y estrategias se orienten hacia un nuevo campo de biomateriales biomiméticos.

El término biomimético fue acuñado en 1957 por el Doctor Otto Schmitt, quien en su tesis doctoral desarrolló un dispositivo físico que imitaba la acción eléctrica de un nervio (BRUSHAN BHARAT, 2012). El biomimetismo es una disciplina que busca imitar la biología o la naturaleza y, de esta manera, generar soluciones tecnológicas. En la ingeniería de tejidos, el biomimetismo es de gran importancia, especialmente en el diseño de biomateriales, ya que puede favorecer respuestas celulares concretas y con esto la formación de tejido nuevo a través de interacciones específicas, potenciando la efectividad del tratamiento desarrollado (SHIN et al., 2003). Por ejemplo, uno de los enfoques más prometedores en el diseño de andamios para ingeniería de tejidos, consiste en imitar la composición y las propiedades estructurales-morfológicas o mecánicas de la matriz extracelular, con el fin de conducir una adecuada respuesta celular (SMITH et al., 2011; SARTORI et al., 2014).

Biocompatibilidad

La biocompatibilidad se refiere a la capacidad de un biomaterial para desempeñar la función deseada de acuerdo con el tratamiento médico, sin provocar ningún efecto indeseable local o sistémico en el beneficiario de la terapia, pero al mismo tiempo generando la mejor respuesta celular o del tejido en esa situación específica. Asimismo, puede optimizar el desempeño clínico de dicha terapia (WILLIAMS et al., 2008).

Existen diversos materiales utilizados en ingeniería de tejidos, los cuales se pueden subdividir en materiales naturales y materiales sintéticos. Dentro de los naturales se incluyen, por ejemplo, el colágeno, los glicosaminoglicanos (GAGs), quitosano y alginatos (GOUGH et al., 2002). Las ventajas de éstos es que poseen una baja toxicidad y una baja respuesta inflamatoria crónica. Sin embargo, dentro de sus desventajas se encuentran las pobres propiedades mecánicas, así como estructuras complejas, que pueden dificultar su manipulación. Es por ello que tienen la posibilidad de combinarse con otros materiales naturales o sintéticos, con el fin de mejorar las propiedades mecánicas manteniendo la biocompatibilidad.

Algunos ejemplos de materiales sinténticos empleados incluyen polímeros como poliácido láctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), poliuretanos (PUs), politetrafluoroetileno (PTFE), polietilentereftalato (PET), biocerámicas como hidroxiapatita (HA) y fosfato tricálcico, y los tradicionales metales para implantes permanentes, tales como como: acero inoxidable, aleaciones cromo-cobalto (Co-Cr) y aleaciones de titanio (Ti) (HOLZAPFEL et al., 2013).

Ingeniería de tejidos del hueso

En las últimas décadas, la ingeniería de tejidos ha emergido como un método alternativo para la regeneración de tejidos y la restauración de la función de órganos a través de la implantación de células o tejidos cultivados fuera del cuerpo o estimulando el crecimiento celular dentro de una matriz que ha sido implantada (VATS et al., 2003).

En lo que al hueso se refiere, una insuficiencia clínica ósea está definida como una discontinuidad en la integridad del hueso como resultado de un trauma, malformación congénita o resección quirúrgica. Este tejido posee la capacidad intrínseca de remodelarse y regenerarse espontáneamente. Sin embargo, dicha capacidad no se extiende a defectos de un cierto tamaño crítico. En esos casos, el hueso no se regenerará por sí solo, por lo que existirá la necesidad de intervenir quirúrgicamente al paciente. La prioridad por regenerar esos defectos óseos de tamaño crítico ha inspirado por más de dos décadas la búsqueda de terapias basadas en ingeniería de tejidos que permitan obtener resultados exitosos desde el punto de vista clínico (SHRIVATS et al., 2014), lo cual implica no sólo que se forme tejido nuevo sino que también se reestablezca la función del hueso.

El presente trabajo tiene como objetivo mostrar diferentes investigaciones realizadas en los últimos cuatro años, las cuales persiguen la síntesis y optimización de biomateriales con la finalidad de que sean empleados a futuro como sustitutos óseos. Distintas estrategias biomiméticas han sido estudiadas con la finalidad de mejorar, entre otras propiedades, la citocompatibilidad de los materiales en cuestión.

1. Crecimiento biomimético de HA en fibras de colágeno

Se ha encontrado que algunos materiales biológicos, como el colágeno, exhiben una orientación uniaxial polar de dipolos moleculares en su estructura y pueden ser considerados como bioeléctricos. Esta característica permite la obtención de nanoestructuras altamente alineadas bajo condiciones biomiméticas. Basándose en dicha cualidad, en un estudio de González-Paz et al. (2011) se logró obtener nanocristales de hidroxiapatita (HA) dentro de fibras de colágeno auto-ensambladas y entrecruzadas.

A partir de tendones de colas de rata se obtuvo colágeno tipo I usando ácido fosfórico H₃PO₄. La nucleación directa de la fase inorgánica (HA) dentro de las fibras de colágeno se realizó con una suspensión acuosa de hidróxido de calcio Ca(OH)₂, hasta que se formara un hidrogel. Después de una semana de secado a 50 ºC se obtuvo un polvo blanco, al cual, posteriormente, se le añadió una solución de genipina (0.5% m/V) como agente entrecruzante y se mantuvo por tres días más a 50 ºC. La genipina es un compuesto de origen natural que se extrae de las flores de gardenia y forma productos estables al reaccionar con aminoácidos o proteínas.

La temperatura de secado empleada (50 ºC) es inferior a la temperatura de desnaturalización (en adelante Td) de la triple hélice de tropocolágeno (Td = 63 ºC), con lo cual se buscaba secar el hidrogel y promover el recocido del biopolímero mediante la organización de la HA dentro de las fibras de colágeno autoensambladas.

A través de calorimetría diferencial de barrido (DSC), se determinó que la Td del compuesto colágeno (35)/ HA (65) sin entrecruzar fue de 65 ºC y la temperatura de fusión (en adelante Tf) Tf = 138 ºC (ver Figura 1). Sin embargo, luego de entrecruzar el colágeno con la genipina, la endoterma de Td desapareció y la Tf incrementó a 155 ºC, obteniendo así una Tf cercana a la de fibras de colágeno/HA de hueso cortical (Tf = 160 ºC), también reportada por otros autores (TREBACZ et al., 2005).



En la Figura 2 (a) se muestra una imagen de microscopía de fuerza atómica (AFM) de las fibras de colágeno biomimético, en la cual se observa un patrón similar al reportado por AFM para fibras de colágeno de hueso cortical (TREBACZ et al., 2005). Los resultados de microscopía electrónica de barrido (SEM) sugirieron una efectiva nucleación de la HA dentro de las fibras de colágeno entrecruzadas. En la Figura 2 (b), las flechas blancas indican los puntos de nucleación en la microfibras de colágeno tal como ocurre en el hueso. Adicionalmente, a través de la técnica de microanálisis por espectroscopia de energía dispersiva (EDS) se encontró una relación de Ca/P = 1.65 en el compuesto entrecruzado, similar a la relación Ca/P reportada para el hueso de 1.67.

Gracias a este método se logró obtener un compuesto de colágeno/HA con características similares a las del hueso cortical. Sin embargo, se requieren estudios futuros para comprobar su posible aplicación como biomaterial en defectos del hueso.

2. Poliuretanos (PUs) a partir de ácidos grasos

Los poliuretanos (en adelante PUs) poseen numerosas aplicaciones en ingeniería de tejidos, particularmente, su uso en medicina ortopédica es bien conocido como sustitutos de hueso e injertos óseos (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2012). Por otro lado, actualmente existe una tendencia por el desarrollo de tecnologías más sostenibles y compatibles con el medioambiente. En el caso específico de los PUs, la estrategia consiste en reemplazar los monómeros convencionales obtenidos a partir de fuentes fósiles, como isocianatos y polioles, por materias primas obtenidas a partir de fuentes renovables.

Por esta razón, ha surgido un gran interés por los aceites vegetales, ácidos grasos y sus derivados para la producción de polioles e isocianatos para producir PUs. La elaboración de PUs a partir de ácidos grasos, tiene también como objetivo mejorar la biocompatibilidad, ya que se obtienen materiales a partir de moléculas más similares a las que abundan en el cuerpo humano.

Con la finalidad de obtener dioles y polioles renovables para la elaboración de PUs y que adicionalmente tengan un potencial uso en ingeniería de tejidos, se aplicó una reacción de aclopamiento tiol-ino a los ácidos grasos: 9-octadecinoico y 10-undecinoico. Éstos fueron obtenidos a partir de los ácidos grasos oleico (OL) y 10-undecenoico (UD), los cuales son los principales productos de saponificación del aceite de girasol alto oleico y pirólisis de aceite de ricino, respectivamente, con grupos funcionales hidroxilo. Los monómeros resultantes fueron polimerizados con diisocianato de difenilmetano (MDI). A partir de los dioles obtenidos se sintetizaron PUs lineales termoplásticos, mientras que de los trioles se sintetizaron PUs termoestables.

Con el fin de evaluar la biocompatibilidad de los PUs, se realizaron estudios de citotoxicidad con una línea celular osteoblástica denominada MG63, durante un periodo de 24 horas a 37 ºC. La viabilidad celular, basada en la actividad metabólica de las células, se midió empleando un ensayo conocido como MTS, el cual se aplica con frecuencia para detectar la citotoxicidad de polímeros por su fiabilidad y sensibilidad. La viabilidad celular medida con respecto a las condiciones del control establecido para el ensayo (únicamente placas de plástico para cultivo celular), en todos los casos fue superior al 75% y no hubo diferencias significativas entre los PUs lineales y los entrecruzados, ni entre los derivados de ácido oleico (OL) o ácido 10-undecenoico (UD).

A través de SEM se estudió la morfología de la superficie de los PUs (ver Figura 3). Después de las 24 horas se encontró que las células se adhirieron exitosamente sobre todas las muestras. En el caso del PU3 (Figura 3 (c)), las células se encontraron bien adheridas y extendidas sobre la superficie, mostrando una morfología plana y normal. Adicionalmente, éstas se encontraban conectadas entre sí a través de extensiones citoplasmáticas, a diferencia de las células sobre los otros PUs (PU1, PU2 y PU4), las cuales mostraron una morfología más redondeada.

Sin embargo, con base en los resultados obtenidos, se pudo concluir que todos los PUs estudiados podrían ser útiles como andamios en ingeniería de tejidos. Para mejorar la citocompatibilidad de los PUs ensayados, será necesario que posteriormente se lleven a cabo más estudios.

3. Bioactividad de poliuretanos en SBF

Se ha reportado ampliamente que uno de los requerimientos esenciales para que un material bioactivo se enlace con el hueso vivo, es la capacidad de dicho material para nuclear iones fosfato y calcio en la superficie y formar una capa de apatita similar a la del hueso (KATO et al., 2000). La bioactividad de un material in vivo puede ser predicha empleando un ensayo in vitro con un fluido simulado del cuerpo, conocido por sus siglas en inglés como SBF (Simulated Body Fluid), cuya composición es similar al plasma sanguíneo humano. La preparación del SBF se realizó siguiendo las especificaciones de Kokubo et al., 1990.

Cuando un material puede formar rápidamente fosfatos de calcio similares a los del hueso en su superficie al sumergirse en SBF, significa que podrá enlazarse al hueso vivo después de un corto periodo de haber sido implantado. Recientemente, la deposición biomimética de fosfato de calcio usando SBF ha demostrado ser un método eficaz para el revestimiento de muchos tipos diferentes de polímeros (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2013).

Se prepararon los PUs de acuerdo con el procedimiento descrito por González-Paz et al., 2011. Las estructuras químicas de los mismos se presentan en la Figura 4.


Los PUs mostrados en la Figura 4, fueron sometidos a un ensayo en SBF a 37 ºC y evaluados a diferentes tiempos, una, dos, tres y cuatro semanas. Durante las primeras semanas de ensayo, no fue posible observar precipitación de fase mineral en la superficie de las muestras. En la Figura 5 pueden observarse las imágenes obtenidas por SEM de los PUs después de cuatro semanas en SBF. En éstas, se evidenció nucleación mineral en todas las composiciones y a través de la técnica de EDS, se analizó el contenido mineral en cada caso (ver Tabla 1).


La relación calcio/fósforo (Ca/P) reportada para PU1 y PU2, fue cercana a 0.5, lo cual puede corresponder a un fosfato monocálcico mono-hidratado (MCPM) y para PU3 y PU4 la relación Ca/P fue cercana a 1, la cual puede corresponder a un fosfato dicálcico dihidratado (DCPD) (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2013). El MCPM es utilizado en algunos cementos de fosfato de calcio en medicina y suplementos minerales en alimentos y bebidas. Por su parte, el DCPD es uno de los precursores de la hidroxiapatita y se emplea en cementos de fosfato de calcio para aplicaciones biomédicas y dentales.


Si bien todos los PUs estudiados mostraron nucleación mineral en su superficie luego de cuatro semanas en SBF, sería conveniente mejorar la bioactividad de las muestras y que la nucleación ocurra en un menor tiempo. Esto último podría ser favorable tanto en una aplicación futura in vivo de los PUs, lo cual aseguraría una unión más rápida con el hueso vivo, como si se desea realizar el método de inmersión en SBF como un tratamiento para recubrir los PUs con fosfatos de calcio. Por esta razón, en un intento por mejorar las propiedades de los materiales en estudio, se realizaron mezclas de los PUs con distintas concentraciones de gelatina, y se consiguió, entre otras, cosas mejorar notablemente la bioactividad de los mismos y reducir los tiempos de nucleación mineral a una semana de tratamiento.

4. Inmovilización de condroitín sulfato en poliuretanos

Una de las estrategias para mejorar la citocompatibilidad de los materiales, es a través de su modificación superficial, con el fin de mejorar la interacción entre el material y las células vivas (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2012).

Las modificaciones superficiales se pueden clasificar en dos grandes categorías (GARCÍA, 2011):

a) Físico-químicas: implican alteraciones de los átomos, compuestos o moléculas de la superficie (modificaciones químicas: oxidación, reducción, silanización, acetilación; modificaciones topográficas: pulido, granallado, entre otros).
b) Recubrimientos superficiales: consisten en la alteración superficial con injertos, recubrimientos covalentes y no covalentes, y deposición de películas.

Dentro de los recubrimientos superficiales, se encuentra la inmovilización de biomoléculas, por ejemplo: enzimas, anticuerpos, lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos (GARCÍA, 2011).

La modificación superficial de PUs a través del anclaje de moléculas bioactivas, permite no sólo mejorar los problemas de compatibilidad de la superficie, sino que también evita alterar las propiedades de resto del material, conservando sus características, por ejemplo, las mecánicas.

Con el objeto de mejorar la citocompatibilidad de los PUs derivados de ácidos grasos obtenidos en el trabajo citado anteriormente, se inmovilizó condroitín sulfato (CS) en la superficie de películas de PUs (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2012). La razón por la cual se seleccionó el CS, un glucosaminoglucano sulfatado, se debe a que éste es uno de los mayores componentes de la matriz extracelular del cartílago y los huesos. Además, juega un papel importante en la regulación de la expresión del fenotipo de los condrocitos, en la diferenciación osteogénica (SCHNEIDERS et al., 2012) y, adicionalmente, se encuentra involucrado en la señalización intracelular, reconocimiento celular y conexión de los componentes de la matriz extracelular con las glicoproteínas de la superficie celular (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2012).

En la Figura 6 se puede observar el esquema de la modificación realizada, la cual consistió en la aminólisis de los grupos éster de la superficie de los PUs y la inmovilización iónica del CS.


Los PUs evaluados son el PU1 (obtenido a partir de UD diol), PU2 (obtenido a partir de OL diol (ver en la Figura 7 la estructura química) y sus versiones modificadas con condroitín sulfato, respectivamente PU1-CS y PU2-CS.


La citocompatibilidad de los PUs fue evaluada nuevamente a través de cultivos celulares con MG63, y el ensayo de MTS mostró que la incorporación del CS en la superficie de los PUs mejoró la viabilidad celular (ver Figura 8). En el caso del PU1, la viabilidad celular aumentó en un 36% después de la inmovilización de CS, mientras que en el caso del PU2-CS el incremento fue de un 10% en comparación con el PU2.

Figura 8. Resultados de citotoxicidad por MTS para los diferentes PUs y muestra control. Estos resultados comprobaron que la presencia de CS en la superficie de los PUs promueve la adhesión celular y mejora la unión celular de los osteoblastos a través de la interacción ligando-receptor. Por otra parte, otra posible explicación es que la presencia del CS hidrofílico favorece la penetración del medio de cultivo en la superficie del material, y de esta manera se mejora la adhesión de las células y su posterior crecimiento.

Al cabo de 24 horas de cultivo celular, se observó gracias a las imágenes obtenidas por SEM (ver Figura 9) que las células se adhieren a la superficie de todos los PUs. Sin embargo, en el caso de las muestras no modificadas con el CS (PU1 y PU2), la morfología de las células evidencia que éstas no se dividieron ni se encuentran extendidas, sino que, por el contrario, se observan aglomeradas. Las células en las muestras PU1-CS y PU2-CS se encontraban bien adheridas, evidencian una morfología extendida y una configuración plana.


La conclusión del presente estudio fue que la inmovilización del CS mejoraba tanto la hidrofilicidad como la citocompatibilidad de la superficie de los PUs, con lo que este método de modificación es adecuado para favorecer la actividad biológica de los poliuretanos derivados de ácidos grasos (GONZÁLEZ-PAZ et al., 2012).

Conclusiones

En los estudios citados en el presente trabajo se consiguió obtener exitosamente, y a través de una ruta novedosa, PUs fabricados a partir de dioles y trioles provenientes de ácidos grasos. Éstos, además de ser más sostenibles, exhiben propiedades adecuadas para que sean considerados candidatos a una aplicación en ingeniería de tejidos. Los resultados aquí mostrados se orientaron únicamente a la parte de citocompatibilidad y bioactividad de los materiales. Sin embargo, resultados adicionales relacionados con propiedades químicas, térmicas y mecánicas de los mismos, pueden ser consultados en las respectivas publicaciones.

Otra de las ventajas que presentaron los PUs en cuestión, es su versatilidad para ser combinados con otras moléculas o compuestos, con el fin de mejorar notablemente su citocompatibilidad. Tal es el caso del estudio con CS.

Por otro lado, a través de un método innovador se logró obtener nanocristales de hidroxiapatita (HA) dentro de fibras de colágeno auto-ensambladas y entrecruzadas con genipina. Dicho compuesto resultó tener características similares a las del hueso cortical, por lo que representa una opción como biomaterial para regenerar en defectos del hueso.

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