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Dentro de los avances más importantes en la investigación biomédica, podemos mencionar, sin lugar a dudas, la creación y el desarrollo de organismos (animales, plantas, parásitos, bacterias y virus), a los que se les han agregado de forma permanente genes funcionales extraños a su genoma. Asimismo, ha sido muy importante el desarrollo de animales que llevan alterados uno o varios genes específicos e incluso animales en los que se ha eliminado o inactivado completamente un gen. Justo hace poco más de una década, gracias a las técnicas para lograr la transmisión en líneas germinales de material genético en ratones, cambió drásticamente la forma de hacer investigación en todas las áreas biomédicas. La introducción de un fragmento lineal de DNA dentro del pronúcleo de embriones unicelulares (o más recientemente en células stem embrionarias), permite el estudio del patrón de expresión de ese gen y las consecuencias biológicas de la sobreexpresión de la proteína exógena codificada por el transgen en tejidos específicos. La mutagénesis de un gen blanco, por medio de recombinación homóloga en células totipotenciales stem embrionarias, ha permitido a los investigadores generar cepas de ratones que carecen de proteínas individuales, suministrando modelos específicos de pérdida de función. Con estas metodologías es posible, en la actualidad, amplificar, modificar o eliminar un gen. Esto nos permite construir, en teoría, cualquier animal, de cualquier especie, con cualquier alteración genética. Los animales modificados, en particular los ratones, pueden ser usados en todas las áreas biomédicas con un gran número de aplicaciones y propósitos, que van desde el conocimiento básico del gen alterado en el contexto total de ese organismo, hasta el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para controlar alguna enfermedad. Estos animales, además, han ayudado a clarificar los mecanismos de acción y señalización que ocurren en los procesos biológicos y bioquímicos, tanto en el desarrollo embrionario, como en los procesos de malignidad generados en el cáncer. Sin lugar a dudas, todas las áreas médicas y biológicas se han enriquecido con el desarrollo de estas metodologías.

¿Qué organismos pueden ser manipulados genéticamente?

En teoría, todos los organismos son susceptibles de ser manipulados genéticamente. Existen trabajos en la literatura en los que las técnicas transgénicas han sido usadas en plantas y en un número grande de animales, como son: la oveja, la cabra, el cerdo, el ganado vacuno, el conejo, la rata, el pez, los insectos, algunos parásitos e incluso el hombre. Sin embargo, la especie más importante ha sido el ratón, ya que fue el primero que se utilizó y en el que se desarrollaron todas las técnicas que han sido usadas exitosamente para la generación de animales transgénicos.

¿Por qué el ratón?

Las ventajas del ratón sobre otros animales experimentales incluyen la capacidad para manipular la información genética nueva, dentro de la célula y de transmitirla a la línea germinal, tiene un ciclo reproductivo muy corto y los tamaños de las camadas son muy grandes. Por otro lado, el ratón es un animal pequeño, manejable, bien caracterizado y muy usado en el laboratorio. Es una especie que cuenta con muchas cepas consanguíneas diferentes. Además, el conocimiento de la biología del ratón es grande. Para el ratón existe un número abundante de anticuerpos y sondas de cDNA, se han construido bibliotecas genómicas y de cDNA para cada cepa de ratón. Los ratones son relativamente baratos en comparación con otros animales experimentales su mantenimiento aún en condiciones de alta seguridad es relativamente sencillo. Por otro lado, en la técnica de células stem embrionarias, necesaria para crear ratones knock-out, las únicas células disponibles, hasta muy recientemente, han sido las células stem embrionarias de ratón. El ratón, también, con la técnica de inyección usada en la gran mayoría de casos para hacer animales transgénicos, es muy conveniente, debido a la disponibilidad de números relativamente grandes de huevos fertilizados, y también a su tamaño y resistencia. Es muy importante hacer notar que la conservación evolutiva nos ha mostrado que tanto los ratones como otros mamíferos son embarazosamente similares a los humanos. Por estas razones la década de los 1990's ha sido llamada "la década del ratón" por el Harvard Health Letter. En el futuro, la expresión transgénica en animales superiores permitirá la producción a gran escala de proteínas recombinantes y otros estudios en los que el ratón no ha sido el mejor modelo. También, la reciente posibilidad de mutagénesis dirigida en células stem embrionarias de rata, permitirá desarrollar y estudiar modelos de enfermedades que requieren técnicas quirúrgicas inaplicables a los ratones.

¿Qué es un Animal transgénico?

Los animales transgénicos portan un fragmento de DNA exógeno en su genoma. Estos animales se fabrican usando una construcción transgénica (plásmido de DNA con la secuencia del gen que se piensa introducir). Con técnicas de DNA recombinante y con técnicas de micromanipulación o transfección, se introducen en la célula blanco para que se inserte este nuevo gen al azar en el genoma celular. Todos los organismos cuyo genoma tiene un gen añadido o alterado en sus células (incluyendo las células germinales), y portan el gen nuevo o alterado, son en el sentido estricto de la palabra, organismos transgénicos. Es decir, todo gen insertado azarosamente y añadido al repertorio genético de un organismo, con la consecuente ganancia de función otorgada por el transgen, recibe el término de animal transgénico. ¿Que es un Animal "Knock-out" o "Knock-in"? Una mutación dirigida (mutación en un sitio predeterminado) con frecuencia producirá una deleción funcional del gen. A esta eliminación específica se le ha denominado "gen targeting" y el producto es un animal mutante que carece de la expresión específica de ese gen y recibe el nombre de animal "knock-out". Por otro lado, un organismo al que se le ha sustituido un gen normal por otro alterado, con mutaciones específicas, recibe el nombre de "knock-in".

¿Qué es la clonación en animales?

Dentro de la manipulación genética de los organismos, existe la posibilidad de crear individuos que lleven la misma información genética derivada de una célula diferenciada. Con esto, no es necesario crear a un individuo a partir de las células germinales haploides o huevos fertilizados, ni tampoco a través de la utilización de células totipotenciales embrionarias. En estos casos, se utiliza el material genético completo de una célula somática y se introduce en un huevo no fertilizado. Este huevo es implantado en el útero de una hembra pseudopreñada y el resultado es un individuo que cuenta con la misma información genética que el donador. Se le ha denominado clonación, ya que es posible generar un número ilimitado de individuos genéticamente iguales, que llevan la misma información genética.

¿Cómo se hace un Ratón transgénico?

Los métodos para hacer ratones transgénicos fueron desarrollados al final de los años setenta y principios de los ochenta. La mayoría de los ratones transgénicos fueron fabricados inyectando una construcción de DNA, que llevaba el gen transgénico en huevos fertilizados. Estos huevos se obtienen a través de las hembras, que fueron inyectadas con hormonas de estro y posteriormente apareadas. Los huevos fertilizados se remueven del oviducto por medio de lavados con solución salina. Finalmente, para la generación del transgénico, unos cuantos cientos de copias del DNA que lleva al transgen, son microinyectados en un volumen de 2-5 picolitros, dentro del pronúcleo masculino, a través de una pipeta de vidrio ultrafina. De esta forma, 10-20 huevos microinyectados son implantados dentro del oviducto de una madre adoptiva (en estado pseduopreñante, después de que ha sido apareada con un macho estéril). Las crías de éstos huevos microinyectados nacen 19-21 días después, completando el ciclo normal de gestación de un ratón. Aproximadamente entre el 10-40% de las crías tendrán el transgen integrado en su genoma. Los animales transgénicos son identificados por el análisis de DNA. El DNA genómico del animal transgénico se aísla a partir de un pequeño fragmento de la cola del ratón. Los ratones transgénicos pasarán el nuevo gen a sus descendientes, siguiendo las leyes Mendelianas. En cada generación aparecerán nuevos individuos que portarán el transgen, así como las características fenotípicas que le confiera la expresión del mismo. Estos individuos transgénicos heterozigotos, pueden ser apareados entre sí, para generar individuos transgénicos homozigotos (Figura 1). De esta forma, es posible evaluar la dosis genética del transgen, es decir, analizar de qué manera influye en el fenotipo del ratón, el grado de expresión del transgen. Un ratón desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA transgénico es llamado transgénico fundador, y sus descendientes (si son criados adecuadamente) son miembros de una línea transgénica genéticamente idéntica. Los genes inyectados dentro de los huevos fertilizados se integrarán en el cromosoma por la llamada recombinación homóloga. Con la técnica de inyección del zigoto es difícil controlar dónde y cómo se integrará el DNA exógeno dentro del genoma. Los genes no se integran dentro de un gen normal, ni tampoco tienen una localización única. El número de copias génicas por célula, varía de animal fundador a animal fundador. No obstante, un animal fundador y una línea transgénica derivada de él, son, en principio, exactamente iguales. Por ejemplo, la rata transgénica, usada como un modelo para la enfermedad asociada al complejo principal de histocompatibilidad HLA-B27, porta aproximadamente 55 copias del gen humano HLA-B27 por célula, y aproximadamente 66 copias del gen humano Beta2-microglobulina. El transgen HLA-B27 parece ser expresado en forma dependiente del número de copias, y la enfermedad resulta de la expresión de HLA-B27 sobre un nivel umbral crítico. Las dos principales partes de un gen, son la región reguladora (promotor) y la región codificadora de la proteína. La expresión del gen es controlada por proteínas reguladoras, unidas a sitios o secuencias de DNA específicas, presentes a lo largo de la parte promotora del gen. Esta unión activa la maquinaria de transcripción y produce el RNA que, después de ser procesado, saldrá al citoplasma para servir como mensajero para la síntesis de una proteína. En la construcción de animales transgénicos, se pueden usar promotores generales que permiten una expresión continua y generalizada del transgen, o bien, un promotor tejido-específico que dará un patrón de expresión más restringido. Un ejemplo dramático de la expresión de un gen de rata en un ratón, se observa en una de las primeras líneas de ratones transgénicos producidas. Estos ratones portaban un gen con la región reguladora de la metalotioneína de ratón (expresada en la mayoría de tejidos), unida a la región codificadora del gen de la hormona de crecimiento de rata. Los ratones transgénicos crecieron dos veces más que sus compañeros de camada, lo que ilustra que la hormona de crecimiento de la rata codificada por el transgen y producida por los ratones transgénicos, tenía un efecto aditivo sobre el gen endógeno de la hormona de crecimiento de ratón.

¿Para qué sirve un ratón transgénico?

Los primeros usos que tuvieron los ratones transgénicos, fueron los estudios de los mecanismos de regulación de la expresión genética. Esto ha permitido analizar el cómo y el por qué un gen específico es activado en algunos tejidos y desactivado en otros. Muchos genes son activos en uno o unos cuantos tejidos del cuerpo y en ciertas etapas del desarrollo. Esto pareciera estar en contra del hecho de que todas las células del cuerpo contienen un idéntico conjunto de genes. Sin embargo, es esta diversidad de expresión de los genes, la que produce los distintos tipos celulares y tejidos del cuerpo. Esto es lo que hace, por ejemplo, a un linfocito diferente de un granulocito. Para determinar exactamente qué parte de la región reguladora activa la expresión de un gen dado, en un tejido particular, se pueden diseñar construcciones con genes que pueden ser rastreados. A estos genes se les ha dado el nombre de "reporteros". Estas construcciones se realizan fusionando la región reguladora del gen en cuestión, con la región gen que codifica la proteína reportera. Los genes reporteros son, muy frecuentemente, tomados de organismos que tienen muy poca similitud con el animal que será transfectado. Por lo tanto, es muy probable que este tipo de genes no sea encontrado en el genoma del animal. Con frecuencia ha sido usado el gen de la beta-galactosidasa de bacterias. Este gen codifica para una enzima que produce un color azul, cuando es expuesto a una sustancia cromogénica llamada X-Gal. El color azul se desarrollará únicamente en el (los) tejido(s) apropiado(s), es decir, en aquellos tejidos de los ratones que recibieron la parte del gen regulador, necesaria para la activación. Otro de los usos que han tenido los animales transgénicos, son los estudios toxicológicos. Los ratones son modificados genéticamente para incrementar su sensibilidad a alguna enfermedad. Se han producido, por ejemplo, ratones propensos a desarrollar tumores, como el transgénico que expresa al oncogen pim y los ratones deficientes en p53. La detección de eventos tóxicos puede ser mejorada, introduciendo "genes reporteros". Estos genes sólo se activarán en presencia de un agente tóxico. De esta manera ayudarán a la detección de sustancias que afecten al organismo. Por ejemplo, para la detección de agentes genotóxicos, se usan los ratones transgénicos Muta Mouse (lacZ) y el Big Blue (lacI). Los mecanismos destoxificadores pueden ser alterados para crear animales mejor adaptados a los efectos tóxicos de algunas sustancias. Por otro lado, los genes humanos que codifican para enzimas o receptores, pueden ser introducidos en un ratón, para "humanizar" una línea de células o tejidos, y, por lo tanto, aumentar la predicción de los efectos tóxicos en los humanos. Para los estudios de mecanismos de acción, los genes pueden ser introducidos para promover manifestaciones de toxicidad, como los ratones transgénicos que desarrollan neoplasia, denominados oncoratones. En ocasiones, la observación de los cambios en el fenotipo, en ratones modificados genéticamente, puede llevar al descubrimiento inesperado de genes o mecanismos responsables de una enfermedad, con manifestaciones similares en el hombre. Este fue el caso del gen de la queratina, involucrado en una enfermedad de la piel, denominada epidermolisis bulosa simplex

¿Cómo se hace un Animal Knock-out?

Las mutaciones génicas sitio dirigidas (Knock-out), llegaron a ser posibles al final de los años ochenta, debido a los avances logrados en las técnicas de biología molecular, así como por el mayor conocimiento de la biología del desarrollo y la reproducción. Un primer requisito importante para desarrollar esta técnica, fue la estandarización de métodos para cultivar y crecer células stem embrionarias totipotenciales de ratón. Cuando las células stem embrionarias son inyectadas en embriones de ratón en un estado suficientemente temprano de desarrollo, éstas forman parte del desarrollo de todos los tejidos del ratón, incluso de los tejidos germinales. En la práctica, los embriones son aislados al tercer día de desarrollo, en el estado de blastocisto. Estos se microinyectan con 10 a 12 células stem embrionarias modificadas genéticamente y posteriormente son implantados en madres pseudopreñadas (Figura 2). Un avance clave en ésta metodología fue el desarrollo de técnicas moleculares para causar mutaciones que bloqueasen la función de genes específicos en las células stem embrionarias, sin alterar la funcionalidad de éstas. En primer lugar, se requiere de la clonación del gen o de un fragmento del mismo, y su propagación en una bacteria. Posteriormente, se diseñan las modificaciones genéticas necesarias para inactivar la función normal del gen. En esta construcción, se añaden genes que confieren la capacidad de inactivar una droga tóxica (usualmente el gen de resistencia a neomicina neor), con el fin de seleccionar a aquellas células que han captado al transgen. Por otro lado, en la construcción se incorpora también otro gen que permite responder a las células transfectadas, al efecto tóxico de otra droga (típicamente el gen de la timidina kinasa (tk) del virus herpes). El producto de este gen fosforila al ganciclovir, un análogo de la guanina, y lo introduce a la ruta metabólica de la síntesis de DNA. Las células que llevan este gen morirán por tener bloqueada la replicación del DNA. La construcción genética es introducida a las células por medio de electroporación. El gen normal es reemplazado con el gen modificado, a través de un proceso llamado recombinación homóloga. Para que este proceso se lleve a cabo, es necesario que el DNA, a ser insertado, contenga secuencias nucleotídicas homólogas al DNA del genoma blanco normal. Las moléculas se alinean una con otra en la orientación correcta. Una vez alineadas, las moléculas de DNA son cortadas y unidas en los extremos que corresponden a las zonas de homología. La secuencia intermedia es reemplazada en el gen endógeno y no sufre ninguna alteración (Figura 3a y 3b). La maquinaria de la célula que tiene que desarrollar la recombinación homóloga, es impresionante, no sólo por su precisión, sino también por su capacidad de buscar y encontrar la secuencia del DNA genómico que complementa el DNA recién introducido. Para darnos una idea de esta complejidad, hagamos la siguiente consideración: si las letras que representan los nucleótidos en el genoma fueran escritas en una página con 3000 caracteres, el genoma de un ratón representaría una biblioteca con 1000 volúmenes de 1000 páginas cada uno. Es por esto, que no nos sorprende encontrar que únicamente en una pequeña fracción de las células transfectadas, se lleve a cabo la sustitución genética específica, es decir, el reemplazo del gen blanco por el gen alterado. Por el contrario, lo que se observa con mayor frecuencia es la inserción al azar del transgen, en sitios no homólogos. También se llegan a encontrar integraciones incompletas de fragmentos del transgen. Las células stem embrionarias que contienen al gen modificado son seleccionadas, en primer lugar, por su resistencia a una droga tóxica semejante a la neomicina (selección positiva), y, posteriormente, por selección negativa para aislar las células que carezcan del gen de susceptibilidad (tk) para la segunda droga, el ganciclovir. Se llama selección negativa, ya que todas aquellas células que expresen este gen morirán en presencia de la droga. El gen tk está colocado en una posición tal que, en el proceso de la recombinación, debe ser eliminado. Aproximadamente, una en un millón de células transfectadas, tendrán el reemplazo del gen específico deseado. Las células recombinantes son inyectadas en los embriones de ratón. Estos son implantados en hembras pseudopreñadas y algunos de los ratones que nacen son quimeras (ratones que tienen células genéticamente diferentes en un tipo de tejido dado). Estos ratones presentarán dos tipos diferentes de células; aquellas que corresponden al genoma del ratón original microinyectado, así como las células derivadas de las células stem embrionarias manipuladas, que llevan el gen modificado integrado en su genoma. El esperma u óvulo presente en los ratones quiméricos, si provienen de las células microinyectadas en el blastocisto, portará los genes alterados. Cuando estos animales se crucen con animales sanos, heredarán una copia del cromosoma que lleva la mutación y que proviene de la célula stem embrionaria microinyectada, formando así animales mutados heterozigotos. Es necesario que estos animales heterozigotos se crucen entre sí para obtener ratones que tengan dos copias del gen mutado, formando así, animales homozigotos knock-out. Estos animales presentan una ausencia completa del gen normal (Figura 4).

¿Para qué sirve un animal Knock-out?

Ratones knock-out que carezcan de proteínas específicas pueden servir como modelos de enfermedades humanas. Uno de los primeros genes blanco para generar un animal knock-out, fue el gen que codifica para el canal del cloro responsable de la fibrosis quística. Estos ratones han sido muy útiles en el estudio de esta enfermedad. Son usados para comprender los mecanismos que llevan a la enfermedad, así como para probar tratamientos con drogas y desarrollar estrategias de terapia génica. Publicaciones recientes indican que los antecedentes genéticos del ratón, que lleva el gen mutado, influye en el fenotipo expresado.

Es importante reconocer que un gen no trabaja solo, sino que es una parte de una cadena o sistema en cascada, en la que con frecuencia un evento dispara algunos eventos subsecuentes. Por lo tanto, las alteraciones genéticas muy definidas pueden tener algunos efectos pleiotrópicos, los cuales explican la dificultad para interpretar el modelo.

Los animales modificados genéticamente y el medio ambiente

Hablar del medio ambiente es hablar de toxicología. Los ratones transgénicos han sido una herramienta importante en el descubrimiento de agentes que dañan el medio ambiente. Los animales modificados genéticamente han sido usados para estudiar enfermedades inducidas por el medio ambiente. La mayor parte de las alteraciones producidas por el medio ambiente recaen en mutaciones tejido-específicas y finalmente en el desarrollo de cáncer. Es bien sabido que determinados factores ambientales, como ciertos agentes químicos, pueden causar cáncer en el hombre. Sin embargo, también ha llegado a ser claro por estudios en modelos experimentales, así como del análisis de resultados derivados de humanos, que hay un fuerte componente genético de la enfermedad. El componente genético involucra algunos genes que influyen en la susceptibilidad y la progresión del tumor. El proceso es complejo, ya que involucra un número grande de eventos y en ellos están varios genes involucrados. Esto ha impedido que se conozcan a detalle los mecanismos involucrados en la formación de un tumor. Como una alternativa, la metodología de los animales transgénicos ofreció la posibilidad de alterar la expresión y la regulación de genes específicos contra un fondo genético constante, abriendo la posibilidad de responder preguntas sobre el cáncer en el ámbito molecular. Está claro que una simple mutación genética, por sí sola, no es suficiente para provocar el desarrollo de un tumor, y que se requieren eventos secundarios, tales como la activación o inducción de genes cooperadores, que también juegan un papel esencial en el desarrollo del cáncer. Estas preguntas pueden ser contestadas sólo en el contexto de los animales transgénicos.

Animales transgénicos y cáncer

Hablando en un sentido amplio, se conocen dos clases de genes que influyen en la formación de un tumor: los genes supresores de tumor, que actúan en forma negativa para controlar el crecimiento celular, y los oncogenes que parecen funcionar en forma positiva. Uno de los genes que mejor ha sido estudiado por técnicas transgénicas, es el gen supresor de tumores p53, cuyo producto parece estar involucrado en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Aparentemente p53 actúa como un guardián del genoma e impide que las células se dividan, hasta que haya sido reparado cualquier daño del DNA que esté presente en el genoma. En una gran variedad de cánceres humanos, las alteraciones genéticas más comúnmente detectadas, son mutaciones que inactivan al gen p53 (80% de todos los tumores). Los ratones que portan un transgen mutante, defectuoso de p53, son mucho más susceptibles a la formación de tumores, que los animales normales. No obstante, el trabajo con el modelo knock-out de p53 presenta resultados sorprendentes y aparentemente contradictorios. En la primera publicación sobre ratones knock-out de p53 encontraron que, aunque estos ratones se desarrollaban normalmente, el 75% de ellos presentaron tumores múltiples a la edad de 6 meses. Además, se han detectado una serie de alteraciones y anormalidades serias en el desarrollo, usando ratones similares a p53 generados de novo. Por otro lado, también se han hecho estudios con el uso de ratones portadores de algunos oncogenes que llevan secuencias reguladoras, que les permiten expresarse en tejidos específicos. Estos ratones han mostrado ser un modelo valioso, en el cual se pueden estudiar, tanto los aspectos genéticos y epigenéticos del desarrollo de neoplasias, como tumores malignos. Los ratones pueden ser útiles, no sólo para el estudio del desarrollo de tumores, sino también para estudiar el uso de compuestos químicos y drogas que tengan, ya sea un potencial promotor de tumores (carcinogénicos), o bien, todo lo contrario. En los casos en los que hay problemas con el modelo de tumor, por ejemplo, por una expresión constitutiva del oncogen a niveles relativamente altos, existe la alternativa de generar animales de expresión transgénica inducible. Los animales transgénicos también se han utilizado como biosensores de carcinógenos potenciales. Por ejemplo, los ratones transgénicos "Big Blue" fueron desarrollados en una colaboración entre el National Institute of Environmental Health Sciences y la Compañía Stratagene. En estos ratones, todas las células contienen al transgen de la beta-galactosidasa, el cual funciona como un gen reportero. Cuando las células de estos ratones mutan por exposición a sustancias químicas mutagénicas, se activa la expresión del transgen y se produce la enzima beta-galactosidasa. Esta estrategia es una forma relativamente rápida y eficiente de seleccionar mutágenos químicos in vivo. Es evidente que la capacidad para identificar mutágenos con potencial carcinogénico, se incrementará con el uso de ratones diseñados genéticamente. La aplicación de estos ratones en la investigación biomédica aumenta cada día, con especial énfasis en el cáncer, enfermedades producidas por microorganismos patógenos, enfermedades degenerativas, etcétera. El uso de tales ratones transgénicos y knock-out será valioso por los estudios mecanísticos en muchas enfermedades. Por otro lado, la identificación y clonación de genes supresores de tumores se ha enfocado principalmente en los síndromes de predisposición a cáncer humano familiar. La manipulación de las células stem embrionarias (ES) ha llevado a la generación de modelos de ratón mutantes, que se asemejan en mucho a los síndromes humanos. Los ratones que carecen de uno o ambos alelos de genes supresores de tumores, han sido generados para evaluar la función normal de estos genes in vivo. Estos ratones han probado ser altamente susceptibles al desarrollo de tumores, indicando que el ratón es un potente sistema de ensayo in vivo para determinar la función de genes supresores de tumores. La iniciación del desarrollo de un tumor gonadal en ratones, que carecen de las copias del gen alfa-inhibina, demuestran que este ensayo también es útil para identificar nuevos genes supresores de tumor. En el futuro, las estrategias de las células stem embrionarias totipotenciales, continuarán usándose para identificar nuevos genes supresores de tumor y analizar sus papeles in vivo en el control del crecimiento.

El sistema inmune y los modelos animales

Los avances en el estudio del sistema inmune han sido el foco de trabajo con animales transgénicos y knock-outs. Existe una gran lista de ratones modificados genéticamente, relacionados con genes del sistema inmune. Entre los resultados obtenidos, podemos mencionar de manera especial el avance en el entendimiento de la tolerancia y la autoinmunidad. Con este propósito, se han desarrollado animales que sirven como modelo de investigación de la diabetes, del lupus eritematoso sistémico, y un gran número de enfermedades autoinmunes. Otro ejemplo, es una línea de ratas transgénicas, que sirve como modelo de enfermedades asociadas al complejo principal de histocompatibilidad HLA-B27. Estas ratas desarrollaron una enfermedad inflamatoria que involucra el tracto gastrointestinal, articulaciones periféricas y vertebrales, tracto genital masculino, piel, uñas y corazón. En la actualidad, se están desarrollando modelos transgénicos para estudiar la autoinmunidad inducida por productos químicos y biológicos exógenos. Asimismo, se ha estudiado el efecto que tiene la sobreexpresión o eliminación de los mediadores del sistema inmune, como son las interleucinas y los factores de crecimiento. Esto es particularmente importante para evaluar el efecto que tienen las citocinas en el hombre, y su uso como inmunomoduladores. Los modelos animales proporcionan información sobre la toxicología de estas sustancias, ayudándonos a entender su mecanismo de acción y regular sus efectos inmunotóxicos. Por otro lado, nos permite evaluar la diferencia que existe entre la administración exógena de estos inmunomoduladores y la producción endógena de los mismos en animales transgénicos. También es posible evaluar las diferencias que existen a niveles moleculares entre péptidos y proteínas naturales, y los producidos biotecnológicamente. En esta área, los ratones transgénicos proporcionan una valiosa información acerca de la toxicología e inmunología de la sustancia en cuestión. Otro aspecto importante dentro de la inmunología, es la hipersensibilidad tardía o alergias. Para esto, se han producido varios ratones transgénicos y knock-out que ayudan en el estudio de la función de varias moléculas del sistema inmune, con relación a la respuesta alérgica, por ejemplo las citocinas IL-4, IL-5 y otras moléculas como CD23 y CD40.

Mutantes naturales vs animales diseñados genéticamente

A pesar de lo impresionantes que puedan ser los resultados obtenidos con animales diseñados genéticamente, no hay que olvidar que muchas mutantes "naturales" y líneas consanguíneas de ratones, están disponibles y en ocasiones pueden ser una buena alternativa a las mutantes hechas por el hombre. Los ratones con inmunodeficiencia severa combinada (SCID) son incapaces de desarrollar una respuesta inmune específica, y no rechazan transplantes. Si son transplantados con células del sistema inmune humano, estos ratones (SCID-hu o ratones hu-PBL-SCID) desarrollarán un cierto grado de función inmune humana. El uso de tales ratones "humanizados" es creciente en la investigación alérgica, y también han sido usados en experimentos en inmunotoxicología. Durante un tiempo se pensó que los ratones SCID eran fenotípicamente similares a los ratones knock-out del gen RAG-2, y que éstos, debido a su homogeneidad, sustituirían a los ratones SCID. Sin embargo, experimentos recientes han demostrado que la función celular inmune humana es mejor en ratones SCID "naturales", que en los ratones RAG-2 deficientes, transplantados con células humanas. Otros modelos animales naturales, son los ratones que carecen de alguna citocina. La naturaleza nos provee con muchas variantes genéticas de ratón, con distintas deficiencias de citocinas. Los ejemplos clásicos, son: el ratón osteopetrótico (op/op), que carece del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el ratón W/W y ratón steel que carecen del receptor c-kit o su ligando, el factor de células stem (SCF), respectivamente. Otros ejemplos interesantes son las mutaciones en el gen Fas, que provoca un fenotipo de linfoproliferación (lpr) y, por otro lado, el ligando de Fas que induce la enfermedad linfoproliferativa generalizada (gld). Los ratones que no producen receptor de la citocina TNF, o bien, la propia citocina, tienen un efecto distinto sobre la apoptosis celular, pero también presentan linfoproliferación.

Citocinas

Las citocinas son proteínas de bajo peso molecular que actúan en su mayor parte, localmente, en los tejidos en forma autocrina o paracrina. Intervienen en la regulación de la función del sistema inmune, en el desarrollo hematopoyético, en la reparación de tejidos y en la inflamación. Las citocinas actúan de forma concertada, permitiendo la supervivencia, proliferación, diferenciación, y maduración de las células. Las citocinas pueden tener efectos activadores o inhibidores del crecimiento. Con frecuencia una sola citocina puede mostrar ambos efectos, dependiendo de las células blanco. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral alpha (TNF-alpha), puede asumir tanto funciones angio o fibrogénicas, como citotóxicas. Es importante reconocer que las citocinas forman una red de comunicación muy fina, entre las células que las producen y las células que responden a ellas. Unas cuantas citocinas son reconocidas como mediadores de toxicidad, tal como el TNF-alpha, el interferón-gama (IFN-g), el factor inhibidor de leucemia (LIF) y la interleucina-1 (IL-1). La distinción de subpoblaciones de linfocitos T cooperadores (Th1 y Th2), puede ser importante para la comprensión del fenotipo de ciertos ratones knock-out. Los linfocitos Th1 promueven una reacción inmune mediada por células, mientras que las células Th2 inducen una respuesta inmune humoral con la producción de anticuerpos. La decisión para que se dé una respuesta de tipo Th1 o Th2 está dada por citocinas inducidas por un antígeno dado. Mientras el IFNg, el IL-12, y la linfotoxina (LTa) llevan a una respuesta de tipo Th1, la IL-4, IL-5, IL10, e IL-13, inducen una respuesta de tipo Th2. Además, las citocinas derivadas de una respuesta Th1 o Th2, tienen efectos inhibitorios recíprocos. Por lo tanto, la inactivación de cualquiera de estos miembros en la compleja cadena de citocinas, puede influenciar una respuesta Th1 o Th2. Las actividades biológicas de las citocinas han sido investigadas in vitro e in vivo por la administración de proteínas purificadas o recombinantes. Los papeles fisiológicos de las citocinas producidas endógenamente en algunas enfermedades experimentales, han sido evaluados por el uso de anticuerpos neutralizantes, una estrategia que ha sido ampliamente explotada con TNF e IFN-g. Sin embargo, las respuestas más claras se han obtenido con el uso de animales diseñados genéticamente. Dos aproximaciones genéticas pueden ser presentadas: la inactivación de un gen definido por recombinación homóloga de células stem embrionarias o el uso de cepas de ratones con mutaciones naturales.

Animales manipulados en los genes de citocinas y de factores de crecimiento

En la mayoría de los casos, la eliminación de genes de citocinas es compatible con la vida normal, sugiriendo que el sistema tiene un alto grado de redundancia. No obstante, algunas mutaciones han sido embrioletales, ya que el gen tiene una función vital durante el desarrollo. En tales casos, para producir el ratón, es necesario usar un promotor inducible y/o tejido-específico. Una opción elegante es el uso del sistema cre-lox. Cre es una recombinasa, la cual tiene la capacidad de eliminar fragmentos de DNA flanqueados por sitios lox-P (secuencias de DNA específicas). Por tanto, una mutación de interés se genera primero por recombinación homóloga, usando un vector blanco que contenga dos sitios lox-P. El gen Cre introduce en el sistema con un promotor tejido -o célula- específico, y el gen flanqueado por los sitios lox-P, es extraído únicamente donde la recombinasa Cre es expresada (Figura 5). Este procedimiento permite la eliminación de los genes de interés que sean dependientes del estado de desarrollo en una etapa específica de la célula, o bien, a través de un inductor específico. En los últimos años, algunos genes de citocinas han sido sobreexpresados o eliminados por técnicas de transgénesis o recombinación homóloga. A continuación se resumen los grandes cambios fenotípicos de estos ratones.

Receptor al factor de crecimiento epidérmico (EGF)

Los animales transgénicos que se han generado, usando al gen de esta citocina, se han creado con la utilización de la región promotora del gen. Se ha evaluado la actividad y la especificidad del promotor del receptor del EGF de humano. La construcción genética lleva el promotor del receptor de EGF humano y secuencias enhancer fusionadas al gen bacteriano de la cloranfenicol acetiltransferasa. El análisis de la actividad de la acetiltransferasa, revela que la construcción está permanentemente activa en el timo y en el bazo. En un análisis más fino, se demuestra que los timocitos per se, no muestran la actividad enzimática del gen reportero, sugiriendo que la expresión del transgen, en el timo, está confinada al estroma tímico.

Eritropoietina (Epo)

Los estudios de ratones transgénicos Epo han revelado que diferentes secuencias de DNA que se encuentran flanqueando el gen Epo, controlan la expresión del transgen en el hígado versus riñón, y que algunas de estas secuencias están localizadas en la región 3', no traducida del gen. Algunas secuencias flanqueadoras 3', de aproximadamente 50 nucleótidos, también funcionan como un enhancer, el cual puede mediar la inducción transcripcional en respuesta a la hipoxia. Las consecuencias de una expresión alterada de Epo han sido demostradas en animales (ratones) transgénicos, expresando niveles incrementados de Epo humano en todos los tejidos transgénicos analizados. La sobreexpresión de Epo lleva a policitemia y a un incremento general en valores de eritrocitos, hematocrito y hemoglobina. También se observa una reducción significativa de plaquetas en estos animales.

Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)

La sobreexpresión del gen que codifica para el GM-CSF, conduce a alteraciones patológicas en la retina, así como a ceguera y deterioro muscular. Estos ratones se caracterizan por un incremento muy pronunciado en la actividad de macrófagos. La sobreexpresión de GM-CSF produce la activación de macrófagos maduros, que secretan grandes cantidades de IL-1 y TNF, sugiriendo que estas citocinas pueden ser responsables de algunos aspectos de la enfermedad del ratón transgénico. El examen histopatológico demostró un pronunciado incremento en la población celular, progenitora del linaje monocítico. Los animales transgénicos que sobreexpresan GM-CSF, mueren a los pocos meses a causa de los daños masivos en los tejidos, como consecuencia de la sobreexpresión de TNF e IL-1. Resultados similares han sido obtenidos con ratones que poseen una médula ósea manipulada, para sobreexpresar GM-CSF por transformación con vectores retrovirales adecuados. Estos hallazgos no parecen ser de significación clínica, ya que el tratamiento de primates y ratones con GM-CSF por tiempos prolongados, no ha demostrado tener complicaciones clínicas.

Interferones

Los interferones comprenden una gran familia de proteínas, entre las que se encuentran: el IFN-alfa y beta (Interferones tipo I), con potentes propiedades antivirales y antiproliferativas, y el IFN-gamma (Interferón tipo II o IFN inmune), cuyo papel es básicamente inmunomodulador. La señal de los IFN se transmite a través de un tipo especial de receptor de membrana, compuesto de al menos dos cadenas. No presentan reacción cruzada con el reconocimiento entre ambos tipos de interferones (I y II) por su receptor, indicando que son altamente específicos. Sin embargo, se sabe que algunas de las rutas de señalización intracelular, son compartidas por los interferones a través de algunos factores de activación. El IFN-gamma es producido por células T cooperadoras Th1 y por células NK. La eliminación del gen para IFN-gamma o su receptor, permite una asignación inequívoca de las funciones de este Interferón in vivo. Los ratones deficientes en IFN-gamma se desarrollan normalmente y son saludables en ausencia de patógenos. Sin embargo, debido a que el IFN-gamma es absolutamente requerido para la activación de macrófagos, los ratones sucumben a dosis letales de patógenos intracelulares (Mycobacterium bovis o Listeria monocytogenes). Asimismo, los esplenocitos exhiben una proliferación descontrolada en respuesta a mitógenos y aloantígenos. Por eso, el IFN-gamma es esencial para la función normal de los macrófagos y algunos otros tipos celulares del sistema inmune.

Receptores a interferones

Los ratones con eliminación del gen del receptor a Interferón gamma (IFN-gammaR), son capaces de producir cantidades normales de IFN-gamma, pero sus células no son capaces de responder a esta citocina. Estos ratones, al igual que el knock-out de IFN-gamma, mostraron un incremento en la susceptibilidad a infecciones por L. monocytogenes y virus vaccinia, a pesar de la respuesta normal citotóxica y de células T-cooperadoras. Además, el IFN-gamma es necesario para producir una respuesta de anticuerpos de isotipo IgG2a. Ratones deficientes en el IFN-gammaR, tienen un dramático incremento de los niveles de IFN-gamma sérico, debido a que el IFN-gamma no es eliminado de la circulación. Estos altos niveles de IFN-gamma no son tóxicos en ausencia de un receptor funcional.

La eliminación del gen que codifica para el receptor del Interferón alfa (IFN-alfaR), conlleva a una dispersión no controlada de los virus, confirmando un papel importante del IFN-alfa en la defensa viral.

Interferón alfa (IFN-alfa)

La expresión de interferón alfa por técnicas transgénicas, en testículo de ratón, ha demostrado ser causa de esterilidad.

Interferón beta (IFN-beta)

La sobreexpresión de esta citocina en animales transgénicos, induce a una resistencia incrementada a infecciones virales y, anormalidades en la fertilidad en animales (ratones) transgénicos que expresan el gen del IFN.

Interferón gamma (IFN-gamma)

La expresión de IFN-gamma en el páncreas de animales (ratones) transgénicos, ha demostrado que precipita la diabetes autoinmune. Provoca infiltración de linfocitos y destrucción celular de los islotes pancreáticos. No obstante, se generan nuevas células que forman islotes a partir de células del ducto. El IFN-gamma induce la neogénesis de los islotes, de forma similar a la morfogénesis embrionaria y ofrece un sistema modelo para estudiar los factores que modulan el desarrollo de los islotes del páncreas.

Los ratones con eliminación específica del gen del IFN-gamma, han sido desarrollados por recombinación homóloga en células ES (stem embrionarias). Estos animales se desarrollan normalmente y son saludables en ausencia de patógenos. Sin embargo, se caracterizan por una producción anormal de productos antimicrobianos y una expresión reducida de antígenos del complejo principal de histocompatibilidad de clase II en los macrófagos. Los ratones deficientes en IFN-gamma mueren por dosis normalmente subletales del patógeno intracelular Mycobacterium bovis. Los esplenocitos muestran una proliferación descontrolada, en respuesta a mitógenos y aloantígenos. Después de una reacción linfocítica mezclada, la actividad citolítica de células T se encuentra aumentada en contra de células blanco alogénicas.

Factores de crecimiento semejantes a la insulina (IGF-1 e IGF-2)

El análisis del crecimiento del cerebro y la mielinización en una línea de ratones transgénicos que sobreexpresan IGF-1, indica que el IGF-1 es un potente inductor de crecimiento del cerebro y mielinización in vivo. En el día 55 postnatal, cuando el crecimiento del cerebro y la mielinización están esencialmente completos en ratones normales, los cerebros de los ratones transgénicos que sobreexpresan el IGF-1, son 55% más grandes que los de los controles, debido a un incremento en el tamaño celular, así como a un mayor número de células. El contenido total de mielina de los ratones transgénicos también está aumentado, y esto es primariamente como resultado de un incremento en la producción de mielina por los oligodendrocitos.

Los ratones mutantes heterozigotos, que tienen eliminado uno de los genes que codifican para el IGF-1, son aproximadamente 10-20% más pequeños que los ratones normales y tienen niveles de IGF-1 menores de lo normal. Los ratones mutantes homozigotos son menores en peso que los ratones normales (60%). Más del 95% de estos animales mueren perinatalmente. La histopatología está caracterizada por un marcado subdesarrollo de tejidos musculares. El tejido de pulmón de embriones tardíos y neonatos está menos organizado, con alvéolos indefinidos. Por lo tanto, el IGF-1, parece ser esencial para el correcto desarrollo embrionario en ratones.

Los ratones heterozigotos que tienen eliminado el gen que codifica para IGF-2, crecen deficientemente cuando el alelo mutado es proporcionado por el padre. En cambio, cuando el gen con la alteración es transmitido maternalmente, la descendencia heterozigota es fenotípicamente normal. Por otro lado, los mutantes homozigotos son indistinguibles en apariencia de sus hermanos heterozigotos con crecimiento deficiente. El análisis de la expresión de los alelos tipo silvestre y mutado, indica que únicamente el alelo paterno es expresado en embriones, mientras que el alelo materno no se expresa. Una excepción es el plexo coroideo y las leptomeninges, en que ambos alelos son transcripcionalmente activos. Estos resultados demuestran que IGF-2 es indispensable para el crecimiento embrionario normal y que el gen de IGF-2 está sujeto a expresión paternal tejido-específico. Los ratones knock-out para el gen IGF-1 también exhiben deficiencias en el crecimiento y éstas son similares a las observadas en mutantes nulos de IGF-2. Algunos de los ratones enanos, deficientes en IGF-1, mueren poco después de nacer, pero otros sobreviven y alcanzan la madurez.

Los mutantes nulos del gen para el receptor IGF-1, mueren invariablemente en el nacimiento, y exhiben una deficiencia más severa en el crecimiento (45% del tamaño normal). Estos animales tienen una hipoplasia orgánica general. Los mutantes dobles, deficientes en expresión de IGF-1 y del receptor para IGF-1, no difieren en su fenotipo de los mutantes sencillos del receptor IGF-1. Los mutantes dobles para IGF-2 y su receptor y de IGF-1/IGF-2, son fenotípicamente idénticos, mostrando enanismo con 30% del tamaño normal.

El uso de oligonucleótidos antisentido inhibe la producción y secreción de IGF-1, por una línea celular fibroblástica de pulmón embrionaria humana (WI-38), y ha demostrado que el IGF-1 actúa como un factor de crecimiento autocrino para estas células.

Interleucina-2 (IL-2)

Las consecuencias de una disfunción en la expresión de IL-2 han sido estudiadas en animales transgénicos que expresan, ya sea el gen humano de IL-2 o el receptor para IL-2, TAC. Los ratones que llevan el gen humano para IL-2 o el receptor TAC, expresan constitutivamente IL-2 en el bazo, timo, médula ósea, pulmones, músculo y piel. Entre otras cosas, estos animales muestran un pronunciado retraso en el crecimiento y mueren prematuramente. Histológicamente se observa una pérdida selectiva de células de Purkinje en el cerebelo y una infiltración focal de linfocitos, terminando en neumonía. El bazo muestra un incremento masivo de células con fenotipo thy1+/CD3-4-8-. La expresión del gen IL-2 humano, que ha sido transferido a células T murinas por medio de un vector viral, provoca un crecimiento autónomo y transformación maligna de las células.

Ratones transgénicos que expresan constitutivamente IL-2 murina en los islotes pancreáticos, mueren tempranamente, debido a una respuesta inflamatoria predominante de macrófagos que destruye el páncreas. Animales con niveles menores de IL-2 sobreviven y tienen islotes que llegan a ser invadidos por infiltrados linfocitarios y desarrollan autoinmunidad en contra de antígenos propios de los islotes.

Ratones homozigotos para la mutación del gen IL-2 son normales con respecto a los timocitos y a la composición de células T, periféricas en las primeras 3-4 semanas de edad. Sin embargo, existe una alteración del sistema inmune, que se manifiesta por una disminución en las respuestas policlonales de las células T in vitro y por cambios dramáticos en los niveles de inmunoglobulinas séricas. Los ratones deficientes en IL-2 desarrollan una enfermedad inflamatoria del intestino en estados tardíos (pasadas las 6 semanas de edad), con una sorprendente similitud histológica y clínica a la colitis ulcerativa en humanos. Con respecto a las respuestas inmunes in vivo. Los ratones knock-out para IL-2, presentan respuestas primarias de células T citotóxicas contra vaccinia y el virus de la coriomeningitis linfocítica. La respuesta de las células T cooperadoras está disminuida, pero biológicamente es funcional. Las actividades de las células asesinas naturales están marcadamente reducidas. La reactividad de las células B contra el virus de la estomatitis vesicular no está alterada. Estas observaciones sugieren que otras linfocinas pueden compensar los defectos de la deficiencia de IL-2 in vivo. La reciente generación de ratones dobles negativos que no expresan IL-2 e IL-4, muestran, sin embargo, que éstos también tienen poblaciones normales de células T y de células B, que mostraron altos niveles de proliferación, indicando que ambas interleucinas no son esenciales para el desarrollo del sistema inmune.

Las funciones de las células productoras de IL-2, también han sido estudiadas, creando ratones transgénicos en los cuales las células productoras de IL-2, fueron sensibles a efectos citotóxicos de la droga antiviral ganciclovir. De esta manera, estas células pueden ser eliminadas selectivamente, en diferentes estados del desarrollo. Estos estudios demuestran que algunas respuestas proliferativas de células T a los antígenos, ocurren por una ruta alternativa que no requiere la síntesis y liberación de IL-2.

Interleucina-4 (IL-4)

La IL-4 promueve el crecimiento y diferenciación de muchas células hematopoyéticas, particularmente linfocitos B y T. Los ratones deficientes en IL-4 tienen un desarrollo normal de células B y T, pero los niveles de suero de IgG1 e IgE están fuertemente disminuidos. En estudios de infección con nemátodos, la IgE no es detectable. Como se sabe, la participación de la IL-4 es muy importante en la diferenciación de las subpoblaciones de células T cooperadoras, Th1 y Th2. Se comprobó la hipótesis de que la inactivación del gen de IL-4 alteraría el patrón de citocinas a una respuesta Th1, típica durante la infección con Nippostrongylus brasiliensis. Como se esperaba, los niveles de citocinas derivadas de Th2 (IL-5, IL-9 e IL-10) fueron muy bajos en ratones deficientes de IL-4 y no se observó la eosinofilia característica de una infección producida por N. brasiliensis. Una cuestión muy interesante fue que la respuesta inmune de las mucosas está disminuida en estos ratones, confirmando el papel importante de IL-4 en la diferenciación de células B, productoras de anticuerpos.

Las consecuencias de la expresión alterada de IL-4, han sido estudiadas en animales transgénicos que sobreexpresan IL-4 humana en todos los tejidos. En estos animales se observa la producción excesiva de altos niveles en suero de IgE. La expresión del transgen de IL-4 interfiere con la maduración de las células T y reduce fuertemente la población de linfocitos CD4-CD8- y de células T periféricas, mientras que los timocitos maduros CD8+ se incrementan excesivamente. Estos animales sufren de blefaritis inflamatoria severa. Los niveles de IL-4 no pueden incrementarse sobre un cierto nivel, debido a que la sobreexpresión descontrolada conduce a la muerte de estos animales. La introducción de un gen IL-4 recombinante y la superproducción resultante, lleva a un estado de independencia del factor en células dependientes de IL-4, aunque no provoca transformación celular.

La expresión de algunos mRNAs de citocinas, tales como los que codifican para IL-5, IL-6, IFN-gamma y también al receptor de IL-4, se encuentra incrementada en ratones transgénicos que sobreexpresan IL-4, mientras que los niveles de mRNA de IL-1, IL-2, IL-3, TNF-alpha y TNF-beta no parecen estar alterados.

La expresión de IL-4 en ratones transgénicos, tiene profundos efectos en la función de las células B. Las células B de estos animales aumentan su tamaño y muestran una expresión elevada de MHC clase II. Los animales presentan un nivel elevado de IgG1 e IgE en el suero y niveles disminuidos de IgG2a, IgG2b e IgG3. Las respuestas de anticuerpo específicas a los conjugados hapteno acarreador, también son afectadas por IL-4. El tratamiento de los ratones transgénicos para IL-4 con anticuerpos neutralizantes para esta citocina, revierte muchas de las alteraciones, lo que sugiere que este cambio se origina como consecuencia directa de la secreción de IL-4.

Los ratones transgénicos para IL-4 establecidos a partir de ratones 129/Sv, genéticamente resistentes a la infección con Leishmania major, son susceptibles a las infecciones por Leishmania, como consecuencia de la inducción predominante de una respuesta inmune de tipo Th2 (dependiente de IL-4), ineficaz para combatir la infección de un parásito intracelular.

Los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-4, bajo el control de secuencias reguladoras derivadas del gen lck (específicas de linfocitos), desarrollan osteopetrosis, como resultado del decremento marcado de formación ósea por los osteoblastos. El timo y las subpoblaciones de células T se desarrollan normalmente. La IL-4 parece jugar un papel importante en el establecimiento de una respuesta inmune Th2 funcional. Las células T CD4-positivas de ratones deficientes en IL-4, fracasaron en producir citocinas tipo Th2, después de una estimulación in vitro. Los niveles de citocinas Th2 IL-5, IL-9 e IL-10 de células T CD4-positivas, obtenidas después de la infección de estos ratones con el nemátodo Nyppostrongylus brasiliensis, están significativamente reducidos. Los ratones deficientes en IL-4, también han demostrado ser resistentes al síndrome de inmunodeficiencia inducida por retrovirus (MAIDS)m, pero no muestran letalidad ni un desarrollo anormal de células T, ambas asociadas con el MAIDS.

Interleucina-5 (IL-5)

Los ratones que sobreexpresan IL-5, tienen una característica eosinofílica en la sangre y en el bazo, que continúa a lo largo de su vida, e infiltración eosinofílica en los pulmones e intestinos, pero permanecen normales y no muestran ningún signo de daño en los tejidos. La administración in vivo de anticuerpos contra el receptor murino IL-5, inhibe la eosinofilia en los ratones transgénicos que sobreexpresan IL-5. Los ratones transgénicos que expresan IL-5 bajo el control de un promotor de la metalotioneína tienen altos niveles de IL-5 en el suero, que pueden ser incrementados por la administración de cadmio. Estos animales muestran un incremento en los niveles de IgA e IgM en el suero. El tratamiento con cadmio produce la expansión de una población de células B Ly-1-positivas en el bazo, las cuales se desarrollan selectivamente por IL-5. El suero de estos animales también contiene concentraciones elevadas de anticuerpos anti-DNA polireactivos de la clase IgM. Los estudios del uso de genes de inmunoglobulinas en los ratones transgénicos para IL-5, muestran que ésta mantiene a las células B CD5-positivas. Por tanto, la IL-5 puede ser responsable de prolongar el periodo de vida de las células B CD5-positivas inmaduras, y de promover la maduración de las células B CD5-negativas, que secretan anticuerpos polireactivos naturales. Los ratones knock-out para la Interleucina 5, tienen un desarrollo normal y se evaluaron en el modelo de infección con Nippostrongylus brasiliensis. La eosinofilia inducida por el parásito en ratones de tipo silvestre, fue eliminada en los ratones mutantes IL-5 -/-. Sin embargo, no se pudo determinar con precisión si el nemátodo es eliminado en ausencia de IL-5.

Interleucina-6 (IL-6)

La IL-6 es una citocina multifuncional con efectos regulatorios sobre los linfocitos B, la hematopoyésis, la inflamación y la respuesta de fase aguda. La sobreexpresión de IL-6 en ratones transgénicos induce plasmacitosis y glomerulonefritis mesangioproliferativa. La sobreexpresión combinada de IL-6 y la proteína receptora transductora de señal, gp130, provoca una hipertrofia miocárdica. Estas observaciones fueron inesperadas y cuestionaron la seguridad de una terapia con IL-6. Sin embargo, en estudios toxicológicos experimentales, se toleró bien la inmunoterapia con IL-6 humana recombinante (rhIL-6). Altas dosis de rhIL-6, dadas a roedores o a primates no humanos, indujeron trombocitosis e incrementaron la síntesis de proteínas de fase aguda sin ningún signo de toxicidad sistémica. Por el contrario, la inactivación del gen IL-6 en ratones knock-out, no provocó ninguna anormalidad grave. Sin embargo, los ratones IL-6 -/- no fueron capaces de controlar la infección con el virus vaccinia, ni tampoco con Listeria monocytogenes, una bacteria intracelular facultativa. Se observó que después de la respuesta inflamatoria de fase aguda, el daño al tejido y la infección están muy desarrollados. Por el contrario, la inyección con endotoxinas disminuye moderadamente la severidad del cuadro. Los resultados preliminares sugieren que la deficiencia en IL-6 provoca una reducción de células precursoras hematopoyéticas. Otra observación interesante es que la inmunidad de las mucosas está severamente reducida y que el número de células plasmáticas productoras de IgA, están dramáticamente disminuidas en la lámina propia de la mucosa del intestino. La plasticidad de la médula ósea, provocada por ovarectomía (semejando la menopausia en la mujer), se demostró que es dependiente de IL-6, ya que fue eliminada en los ratones knock-out a IL-6.

La eliminación de NF-IL-6, el cual es un activador transcripcional de muchos genes, incluyendo IL-1, IL-6, TNF, IL-8, NOS, da como resultado ratones que son altamente susceptibles a infección con L. monocytogenes. Investigaciones ultraestructurales en macrófagos derivados de estos animales, han revelado el escape de grandes números de bacterias desde el fagosoma al citoplasma. Sin embargo, los niveles de TNF, IFN-gamma y de óxido nítrico en estas células son normales. Finalmente, la inactivación del receptor de señal gp130, da como resultado un desarrollo distorsionado del corazón y del sistema hematopoyético, causando la muerte intrauterina en etapas tardías de la embriogénesis.

Los animales transgénicos que sobreexpresan al gen humano de la IL-6, muestran unos niveles en suero de IL-6 e IgG1 policlonal dramáticamente elevados. Desarrollan plasmacitosis masiva y todas las indicaciones de una glomerulonefritis mesangial proliferativa. Los ratones transgénicos que expresan IL-6 bajo el control del promotor del gen de la queratina humana, expresan IL-6 en células epiteliales escamosas. Estos ratones son mucho más pequeños que los ratones normales y también presentan un desarrollo tardío de la piel, con un incremento en la proliferación de las células epidérmicas, aunque no se observa una infiltración de leucocitos. La expresión intracerebral de la IL-6 en ratones transgénicos ha demostrado estar asociada con síndromes neurológicos, y la severidad de los mismos se relaciona con el nivel de expresión de IL-6. Estos ratones se caracterizan por presentar enanismo, temblor, neurodegeneración, astrocitosis, angiogénesis e inducción de la producción de proteínas de fase aguda, sugiriendo un papel patogénico directo de IL-6 en enfermedades inflamatorias, infecciosas y neurodegenerativas del SNC. Las actividades biológicas de IL-6 también han sido estudiadas en ratones deficientes de esta citocina, generados por eliminación específica del gen IL-6 en células stem embrionarias. Los ratones deficientes en IL-6 de ambos sexos, son viables y fértiles y no presentan ninguna anormalidad fenotípica. No obstante, el análisis del metabolismo óseo de las hembras demuestra que estos animales tienen mayores tasas de reorganización ósea que los compañeros de camada controles. En estos ratones, la ovarectomía, la cual incrementa la reorganización ósea en animales normales, no induce ningún cambio, ya sea en la masa ósea o en las tasas de remodelación ósea. Estos resultados sugieren que IL-6 juega un papel muy importante en la regulación local de la reorganización ósea y parece ser esencial en la pérdida ósea causada por deficiencia de estrógenos.

Interleucina-7 (IL-7)

El papel de IL-7 en el desarrollo del sistema linfoide, ha sido estudiado en animales (ratones) transgénicos que llevan el cDNA de la IL-7 fusionado a un promotor y a un enhancer de la cadena pesada de inmunoglobulina. El transgen es expresado en la médula ósea, nódulos linfáticos, bazo, timo y piel. La expresión conduce a la alteración del desarrollo de las células T, que se caracteriza por una marcada reducción de linfocitos CD4+CD8+ (dobles positivos). Los animales también desarrollan un desorden cutáneo progresivo, involucrando un infiltrado linfoide dérmico que resulta en una alopecia progresiva, hiperqueratosis y exfoliación. La expresión del transgen también provoca el desarrollo de un desorden linfoproliferativo que provoca la aparición de linfomas de células T y B dentro de los primeros 4 meses de vida, demostrando que la IL-7 puede actuar como un oncogen en el organismo viviente.

Una alta incidencia de enfermedades linfoproliferativas se ha observado también en una nueva cepa recién generada de ratones transgénicos, que expresan la IL-7 murina bajo el control del promotor E alpha (MHC clase II). Estos animales se caracterizan por la expansión selectiva de las células B en un estado temprano de desarrollo y por la expansión de células fenotípicamente idénticas a poblaciones de células stem bipotentes (células B/macrófago), las cuales son características de la etapa media de gestación embrionaria del hígado. Estas células son oligoclonales o, en casos raros, monoclonales, e incluyen clonas de células cuyos loci de la cadena pesada de Inmunoglobulinas no están rearreglados. La IL-7 es un potente estimulador de células T y B inmaduras. Los ratones mutantes con un gen IL-7 inactivado tienen linfopenia profunda, debido a la maduración defectuosa de células B en la médula ósea. El timo y el bazo tienen disminuidas distintas poblaciones celulares. Por lo tanto, en contraste con otros ratones deficientes de citocinas, los ratones knock-out IL-7 exhiben anormalidades linfoides severas.

Inteleucina-8 (IL-8).

El bloqueo de la expresión de IL-8 en algunas líneas celulares de melanoma humano por oligonucleótidos antisentido, ha demostrado que la IL-8 funciona como un factor de crecimiento autocrino. La observación de que los oligonucleótidos antisentido bloquean la actividad angiogénica inducida por los monocitos, sugiere una participación de IL-8 en la angiogénesis, mediada por los macrófagos.

Interleucina-10 (IL-10)

La expresión transgénica de IL-10 en los islotes de Langerhans de ratones transgénicos, conduce a una pronunciada inflamación pancreática, sin inflamación de los islotes de Langerhans y sin diabetes. Este reclutamiento de células inflamatorias hacia el páncreas está en marcado contraste a las actividades biológicas de IL-10 in vitro, e indican un papel para la IL-10, como una poderosa citocina supresora. Por lo tanto la IL-10 produce una potente señal reclutadora para la migración de leucocitos in vivo, y estos efectos son importantes para aplicaciones terapéuticas de IL-10. Los ratones transgénicos en los cuales el gen de la IL-10 ha sido inactivado por "gen targeting" en células ES, han sido generados para estudiar las actividades biológicas de la IL-10. Estos ratones muestran un desarrollo normal de linfocitos y respuestas de anticuerpos. No obstante, la mayoría de los animales que se desarrollan lentamente, son anémicos y sufren de enterocolitis crónica. Se observa una hiperplasia extensa de la mucosa intestinal, reacciones inflamatorias y expresión aberrante de moléculas MHC clase II. La observación de que estos animales únicamente desarrollan una inflamación local limitada al colon proximal, si se mantienen bajo condiciones específicas libres de patógenos, sugiere que IL-10 es un regulador esencial en el tracto intestinal y que la inflamación generalizada del intestino es debida a respuestas inmunes descontroladas, estimuladas por antígenos entéricos. La IL-10 es una citocina típica Th2 que inhibe una respuesta inmune Th1 (respuesta inmune de tipo celular) y promueve una respuesta tipo Th2 (respuesta de anticuerpos). Por lo tanto, se espera que la inactivación de IL-10, promueva una respuesta Th1. Esto se comprobó con los ratones deficientes en IL-10. Algo muy interesante fue que los ratones IL-10 -/- desarrollaron una colitis ulcerativa, semejante a la enfermedad inflamatoria del intestino de los ratones IL-2 -/-.

Interleucina-12

La IL-12 es una citocina heterodimérica, derivada de los macrófagos con potentes efectos estimulatorios sobre células T y células asesinas naturales (NK), las cuales liberan IFN-gamma que activa a los macrófagos. La inactivación de cualquier componente del heterodímero IL-12 (p35 o p40), permite el desarrollo normal de los ratones, pero se observa una disminución en la respuesta Th1 en algunos modelos experimentales.

Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)

Un modelo transgénico en el cual el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa fue colocado bajo el control transcripcional del promotor de la cadena B de PGDF, demostró que el transgen es expresado preferencialmente dentro de los cuerpos celulares neurales en el cortex, hipocampo y cerebelo. El PGDF puede actuar como un poderoso agente regulador neuronal, contribuyendo a la regeneración nerviosa y a la proliferación glial que produce gliosis y cicatrización.

Factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa)

El papel del TGF-alfa es ejemplificado en animales transgénicos que expresan el factor en todos los tejidos. Estos animales se caracterizan por un marcado estado hiperproliferativo en algunos tejidos. La sobrexpresión de TGF-alfa está mediada por el promotor MMT-1 e induce una hiperplasia epitelial, neoplasia de hígado y desarrollo anormal de la glándula mamaria (carcinomas) y del páncreas (metaplasia). La sobreexpresión del transgen TGF-alfa en ratones, provoca una alta incidencia de tumores de hígado. El TGF-alfa puede funcionar como un promotor de carcinogénesis del hígado, a través de su efecto como un inductor autocrino de la proliferación hepatocítica, favoreciendo la progresión de tumores.

Los ratones transgénicos TGF-alfa también muestran una actividad de células NK reducida y concentraciones incrementadas de estradiol en el plasma. La expresión de TGF-alfa en ratones transgénicos, también induce lesiones estructurales y funcionales dramáticas de la glándula estomacal, que son similares a la enfermedad de Menetrier en humanos. Estos animales desarrollan hiperplasia adenomatosa severa, que da como resultado un engrosamiento nodular o hipertrofia de la mucosa gástrica. Las secreciones obtenidas de estómagos afectados, no contienen ácido gástrico detectable, sugiriendo un funcionamiento celular parietal pronunciadamente disparejo. Los ratones que sobreexpresan TGF-alfa, bajo el control del promotor de la metalotioneína tienen, en promedio, 20% de reducción del peso corporal, comparados con los compañeros de camada no transgénicos. Esta pérdida de peso es el resultado de decrementos significativos en los pesos comparativos de huesos, músculo y, especialmente, grasa. A pesar de su efecto sobre el desarrollo adiposo, la introducción del transgen metalotioneína-TGF-alfa en el background genético ob/ob de ratones obesos, no cambia la marcada obesidad característica de esta mutación. Animales transgénicos que coexpresan TGF-alfa y el oncogen myc, desarrollan tumores en páncreas e hígado, con una apariencia más maligna que los animales transgénicos que expresan solamente myc. Los ratones transgénicos para TGF-alfa muestran un dramático incremento en la incidencia de tumores de hígado inducidos por diversos agentes, demostrando que la sobreexpresión de TGF-alfa complementa la iniciación y promoción de la hepatocarcinogénesis. El papel fisiológico de TGF-alfa ha sido explorado también por la eliminación del gen en un modelo de ratón, usando recombinación homóloga en células stem embrionarias. Los ratones mutantes homozigotos son viables y fértiles, pero muestran un pronunciado movimiento de los pelos de la barba y de la piel, acompañado por una curvatura anormal, desorientación y mal alineamiento de los folículos capilares. Los ratones homozigotos y, en menor extensión, heterozigotos, también muestran anormalidades del ojo de variable incidencia y severidad, incluyendo párpados abiertos al nacimiento, tamaño ocular reducido y opacidad superficial. El examen histológico revela disgénesis de párpado y segmento anterior, inflamación corneal y cicatrización, y defectos en cristalinos y retinas. Similares defectos en los ojos y en el pelo han estado asociados previamente con la mutación recesiva waved-1 (wa-1), y cruzas entre homozigotos wa-1 y ratones deficientes en TGF-alfa, confirman que wa-1 y TGF-alfa son alélicos diferentes.

Factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta)

Los animales (ratones) transgénicos que sobreexpresan el TGF-beta, se caracterizan por tener una marcada reducción en los números de células replicantes en la epidermis y en los folículos pilosos. Muestran una ortohiperqueratosis compacta y una reducción en el número de folículos pilosos. La piel es brillante y muy estirada, y los animales están rígidos y parecen estar restringidos en su habilidad para moverse y respirar. Estos animales usualmente mueren a las 24 horas de nacidos. La sobreexpresión de TGF-beta ha sido investigada también en ratones transgénicos, que llevan un gen quimérico formado con el cDNA del TGF-beta porcino, colocado bajo el control de elementos regulatorios del gen de la proteína acídica del suero. Las hembras de 2 ó 4 líneas transgénicas, han sido encontradas incapaces de lactar, debido a la inhibición de la formación de estructuras lobuloalveolares y a la supresión de la producción de la proteína de la leche. El TGF-beta juega un papel importante in vivo en la regulación del desarrollo y función de la glándula mamaria.

La eliminación del gen TGF-beta, por recombinación homóloga en células stem embrionarias murinas, ha mostrado que los animales homozigotos no muestran grandes anormalidades en su desarrollo, pero a los 20 días después de nacidos sucumben al síndrome de decaimiento, acompañado por una respuesta celular multifocal mezclada con inflamación y necrosis de los tejidos, que conduce a un fallo de los órganos y a la muerte. El examen histopatológico revela una respuesta inflamatoria excesiva, con una infiltración masiva de linfocitos y macrófagos en muchos órganos, pero primariamente en el corazón y los pulmones. Muchas lesiones se asemejan a las encontradas en desórdenes autoinmunes, rechazo de transplantes o ciertas enfermedades virales. Este fenotipo sugiere un papel prominente para TGF-beta en la regulación homeostática de la proliferación de células inmunes y de la extravasación hacia los tejidos. Se ha demostrado que ratones deficientes en TGF-beta expresan elevados niveles de antígenos MHC clase I y clase II.

Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa)

La sobreexpresión de TNF-alfa precipita poliartritis inflamatoria crónica, la cual puede ser impedida completamente por el tratamiento de los animales con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el factor humano. Los ratones transgénicos que sobreexpresan constitutivamente TNF-alfa en células T, bajo el control de señales regulatorias del gen humano CD2, desarrollan marcados cambios histológicos y celulares en sus órganos linfoides y un síndrome de decaimiento letal, asociado con una trombosis vascular dispersa y necrosis de los tejidos. Estos cambios pueden ser neutralizados por la administración de anticuerpos monoclonales específicos contra el TNF-alfa humano. En otro modelo de ratón de TNF-alfa, en donde la expresión del transgen se realiza en células pancreáticas murinas, se ha observado una insulitis severa y permanente sin evolución hacia diabetes. La línea de ratón transgénica que lleva una construcción con el gen reportero de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa, bajo el control de secuencias regulatorias de TNF, muestra que la expresión de la transferasa dentro de los tejidos refleja la expresión de TNF. El análisis de estos animales demuestra que la transferasa es expresada constitutivamente en el timo materno y fetal, y en la placenta, pero no en otros tejidos. La cruza entre ratones transgénicos y no transgénicos indica que el trofoblasto, más que el útero, es la fuente de la actividad transferasa. Una proteína quimérica formada por el receptor soluble de TNF y la cadena pesada de la IgG, la cual inhibe fuertemente la actividad TNF in vitro e in vivo, puede cruzar la placenta pero no interrumpir el embarazo, y no tiene efectos obvios en el desarrollo fetal. Estos hallazgos sugieren que el TNF puede no ser requerido para completar la gestación normal. Estudios recientes con ratones deficientes en la expresión del receptor del TNF (p55) en células stem embrionarias, demuestran que el desarrollo de los timocitos y de las poblaciones de linfocitos es normal, y que la deleción clonal de células T, potencialmente autoreactivas, tampoco está alterada. La pérdida de funciones de p55 en estos ratones, la cual aún expresa el receptor del TNF p75, genera ratones resistentes a dosis letales de lipopolisacáridos o enterotoxinas bacterianas. Sin embargo, estos ratones sucumben fácilmente a infecciones con L. monocytogenes.

Factor de necrosis tumoral beta (TNF-beta)

Las actividades biológicas del TNF-beta han sido estudiadas en animales (ratones) transgénicos, que expresan el gen TNF-beta bajo el control del promotor de insulina II de la rata, en el páncreas, el hígado y la piel. La expresión de TNF-beta en ratones transgénicos provoca un infiltrado leucocitario inflamatorio, constituido fundamentalmente por células B B220+ IgM+, células T CD4+ y CD8+. La insulitis es reminiscente de los primeros estados de diabetes, aunque los ratones no progresan a diabetes.

Lista de animales knock-out disponibles en la actualidad

5-Lipoxygenase, 5-Lipoxygenase-activating protein (FLAP), Acid Alpha-glucosidase gen (Gaa), Acrosin, Acute Regulatory Protein (StAR), Adenosine A2a receptor Adenosine, deaminase (ADA), alpha 1 (IX) collagen, alpha calcium-calmodulin kinase II (alpha CaMKII) Alpha1b-adrenergic, Alpha-Galactosidase A, Apc(delta716), Amyloid precursor protein (APP), Angiotensin-converting enzyme (ACE), Angiotensinogen, aP2, ApoA-I, Apo B, ApoC-III, Apo E, Apolipoprotein A-IV, Atm, B7, Bax, Bc16, Bcl-2 Bcl-3, Bcl-x, Beta 1, 4-galactosyltransferase (GalTase), Beta 1 integrin, Beta 2-microglobulin, Beta-3 GABAA receptor, Beta-galactosidase, BMP7, Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), C5a receptor, c-abl Calcineurin A alpha, CD2, CD22, CD28, CD3 epsilon, CD3 eta/phi, CD3 zeta/eta, CD30 CD4, CD40, CD40L, CD45, and p561ck, CD45-exon 6, protein tyrosine phosphatase, CD8, CD8 beta-1, C/ebp Alpha, C/EBP beta, (CCAAT/enhancer-binding protein beta), Cellular glutathione peroxidase (GSHPX-1), c-Fos, Ciliary Neurotrophic Factor, c-jun, C kappa, c-mos, c-myc, CNTF, CNTFR alpha, Cox 2, CRABPI, Creatine kinase (CK), CREB, CREM, c-rel proto-oncogene, c-ret, CRH, CSF-1, CSK, Ctla-4, Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), D1A, dopamine receptors, Dazla, Desmin, DNA methyl transferase, DNA repair gene (ERCC-1), Dopamine D2 receptors, Dopamine D4 receptor, Dv11, E2a, E2f-1, E-cadherin, EDN3, EGFR, En-1, En-2, Endothelial selectins, Endothelin-B receptor (EDNRB), Enx (Hox 11 L1), Epidermal growth factor receptor (Egfr), ErbB4, Estrogen receptor, Ets-related factor, TEL ,Factor IX, Fas and Perforin, Fc epsilon RI, FcR gamma chain,Fgf4, FGF5, FGF-6, Fibrillin-1, Fmr1, FosB, FSH b subunit, Ftz-F1, fyn, G-CSF, GAD67, Gelationase A (matrix metalloproteinase), Gelsolin, Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Glucocerebrosidase, GluR-B, GLUT4, GM-CSF, G protein-coupled, inwardly rectifying K+ channel, GIRK2, G protein-coupled receptor kinase 3, Growth hormone receptor/binding protein, H2-M, Hdh ex 5, Helix-loop-helix gen E2A, Hoxa-1, Hoxa-2, Hoxa-4, Hoxa9, Hoxa-11, Hoxb-4, Hoxd-3, Hoxd-13, Hsp 70-2ICAM-1ICAM-1 and P selectin,,IFN-gamma, IFN-gamma receptor, Ikaros, IL-1 Beta Converting Enzyme, IL-1 type I receptor, IL-2, IL-2 receptor, betaIL-4, IL-6, IL-7, IL-10, Immunoglobulin D, Immunoglobulin heavy chain joining region, Immunoglobulin heavy chain intron enhancer, Immunoglobulin kappa chain, Immunoglobulin kappa chain intron enhancer, Immunoglobulin mu chain Inhibin Inducible, nitric oxide synthase (iNOS), int-1, int-2, Insulin, (Ins1, Ins2), Insulin-like growth factor I, (Igf-1), Insulin-like growth factor I receptor (Igf1r)), Insulin-like growth factor II (IGF-II), Insulin-like growth factor type 2 (Igf2), receptorInsulin receptor substrate-1 (IRS-1), Integrin-associated protein (IAP), Interferon consensus sequence binding protein, Interferon regulatory factor 1 (IRF-1), Interferon regulatory factor 2 (IRF-2), Interleukin-2 Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7, Interleukin-7 receptor, Interleukin-11 receptor (IL11RA), IX factor, Jnk3, Keratin 8, Keratin 10, Keratinocyte Growth Factor (KGF), K-ras Krox-20, Ku70, L14 S-type lectin, Lag3, Lama2, Lck, Lecithin: cholestorel acyltransferase (LCAT), LIF, L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase (EC 2.1.1.77), Low density lipoprotein (LDL) receptor, LDL Receptor-Related Protein, L-selectin, Lymphotoxin, Lyn, Mammalian achaete-scute homolog 1 (Mash-1), Mannose 6-phosphate receptor, mdr2, mdrla P-glycoprotein, Melanocortin-4 receptor, Metallothionein I and II (MT I and MT II), Mgat-1, mGluR1, mGluR2, mGluR6, MHC class I and MHC class II, MHC class I, MHC class II, MHC class II invariant chain, MKK4, MLH1, MLP, Mu chain, Mu-opioid receptor, Mullerian-inhibiting substance (MIS), Muscle creatine kinase (M-CK), Myf-5 and MyoD, Myogenin, N-cadherin, Neural-cell adhesion molecule (N-CAM), Ncx/Hox 11L.1, Neural nitric oxide synthase (nNOS), Neuropeptide Y (NPY), Neuregulin, Neurotrophin-3 (NT3), Neurotrophin-4 (NT4), Nuetral Endopeptidase, Nf1, NFAT1, NF-kappaB2, NGF, NGFI-A, (Egr-1)(Krox-24), NMDA receptor 1 (NMDAR1), N-myc, Oxytocin, p21 CIP1/WAF1, p27kip1, p53, p561ck and CD45, P75NTR, PDE gamma, Pemphigus vulgaris antigen (desmoglein 3; dsg3), Perforin, Perforin and Fas, Peripheral myelin protein 22 (PM22), Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, PKC beta, PKCgamma, Pkd1, Plasminogen activator (PA), Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), Platelet-derived growth factor (PDGF), Plp, PO, Poly(ADP-ribose) polymerase, Polycomb-M33, Presenlin-1, Pre-proenkephalin, Progesterone receptor (PR), Proteasome subunit LMP-7 PrP, P selectin, P and E selectins, P selectin and Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), Pxr1 R II alpha RII beta subunit of Protein Kinase A, Rad51, rag-2, Rb-1, Retinoic acid receptor alpha (RAR alpha), RelB, Renin Ren-1d Rhodopsin, Rod cGMP, phosphodiesterase gamma subunit, RXR alpha, Selenocysteine tRNA gen (Trsp)-, Semaphorin III/D, SMN, SP-B, Sp1, Stat 1, STAT5A, SREBP-1, Synapsin I TAP1, Tensin, TCR-alpha-beta, TCR delta, T cell receptor zeta chain, TdT Tenascin C, TGF-alpha, TGF-beta 1, TGFbeta2, TIMP-1 Tissue factor (TF), TNF receptor I, t-PA, TPO, Transthyretin, trkB, Tumor necrosis factor, Tyrosine Phosphatase, u-PA, Urate oxidase, Vascular /endothelial-cadherin (VE-cadherin), vav, VCAM1, V (H) 81X, VHL, Vimentin, WT-1, XPA, XPC.

Fenotipos selectos de algunos ratones knock-out Gen alterado y efecto mayor:

abl

Incremento en la mortalidad perinatal; bazo anormal, cabeza y desarrollo del ojo; reducciones mayores en progenitores celulares B de médula ósea adulta.

Bcl-2

Crecimiento retardado; muerte temprana, involución apoptótica masiva de timo y bazo, desaparición de linfocitos T y B de médula ósea, timo y periferia, sensibilidad incrementada de linfocitos T a glucocorticoides e irradiación g.

BDNF

Severas deficiencias en coordinación y balance; excesiva degeneración en algunos ganglios sensoriales. El ganglio simpático, el cerebro medio dopaminérgico y las neuronas motoras no se encuentran afectados.

b2-microglobulina

Ratones fértiles y aparentemente saludables, poca si alguna expresión antigénica MHC clase I funcional, células CD4- y CD8+ no maduras, defectos en citotoxicidad mediada por céluas T CD4-CD8+.

CNTF

Sin cambios morfológicos o funcionales durante las primeras semanas postnatales, atrofia progresiva y pérdidas de neuronas motoras con el incremento de edad.

Creb

Fenotipo enano con glándulas pituitarias atrofiadas,marcadamente deficientes en células somatotrofas, pero no en otros tipos celulares.

Fos

Osteopetrosis severa, osificación del espacio medular, gametogénesis retrasada o ausente, linfopenia; conducta alterada; algunos animales sin fenotipo discernible.

fyn

Timocitos refractarios a estimulación a través del receptor de células T; maduración normal de células T periféricas; Aprendizaje espacial alterado y defectos en el desarrollo hipocampal.

GATA-1

Incapacidad para generar eritrocitos maduros.

HCP

Mutación espontánea: múltiples defectos de células T y B; múltiples defectos hematopoyéticos.

a-inhibina

Desarrollo de tumores estromales gonadales mezclados o incompletamente indiferenciados.

IRF-1

Carencia de la inducción de IFN tipo I observada normalmente por poli(I) poli (C); reducción profunda en células T ab+ CD4- CD8+.

IRF-2

Supresión de hematopoyésis de la médula ósea; los animales mueren después de la infección con el virus de coriomeningitis linfocítica; sobreexpresión de IFN tipo I después de la infección con el virus de la enfermedad de Newcastle.

jun

Muerte a media gestación; reducción drástica en la formación de teratocarcinomas por células ES inyectadas careciendo de jun; hepatogénesis alterada con hipoplasia pronunciada del compartimento epitelial; eritropoyésis del hígado fetal alterada; Edema de tejido generalizado.

lck

Atrofia tímica pronunciada; reducción dramática en la población de timocitos doble positivos (CD4+ CD8+); timocitos maduros simple positivos no detectables; muy pocas células T periféricas.

LIF

Viable; fracaso de implantación en el útero; rescate por transferencia al útero de ratones hembras normales; números dramáticamente disminuidos de células stem en el bazo y la médula ósea; números de progenitores reducidos en bazo pero no en médula ósea.

myb

Todos los linajes hematopoyéticos afectados con la excepción de megacariocitos; eritropoyésis confinada al saco vitelino; muerte a los aproximadamente 15.5 días de gestación debida a anemia severa.

myc

Letal etapa embrionaria al día 9.5.

NGF p75 R

Animales viables y fértiles; decremento marcado en la inervación sensorial relacionada a la calcitonina y a las fibras de la sustancia P-inmunoreactiva; no hay disfunciones de neuronas simpáticas; neuronas trigeminales sensoriales cutáneas embrionarias requieren más NGF para sobrevivir.

pim-1

Las células tronco pluripotenciales derivadas de médula ósea presentan problemas de crecimiento cuando son estimuladas con IL3, pero no con IL4, IL9 o SCF.

pit-1

Ratones enanos Snell-Bag; cerebro microcefálico con hipomielinización, crecimiento neuronal retardado, y subdesarrollo de axones y dendritas; crecimiento hormonal y deficiencia en prolactina.

SCF

Embriones letales (mutación Steel); anemia pronunciada y severo desajuste del desarrollo del sistema hematopoyético caracterizado por una deficiencia muy pronunciada en células tronco pluripotenciales.

SCF R(kit)

Locus white; alteraciones en el color de la cobertura; desarreglo del desarrollo gonadal; reducción de precursores celulares eritroides tempranos.

trkB

Los ratones se desarrollan hasta el nacimiento; mueren poco después de nacer, debido a deficiencias neuronales múltiples.

wnt-1

Muerte poco antes de nacer; en ocasiones sobreviven con ataxia severa; anormalidades severas en el desarrollo del mesencéfalo y el metaencéfalo.

Animales modificados genéticamente y el sistema nervioso

El sistema nervioso es sin duda uno de los órganos más complejos de todos los que componen a un organismo superior. Las técnicas de biología molecular no han podido descifrar aún sus misterios. Sin embargo, la metodología de los transgénicos y los knock-out, han traído una luz que nos permite asomarnos a este fascinante mundo de intrincadas conexiones y finos detalles. A continuación se mencionan algunos de los modelos animales que se han desarrollado para el sistema nervioso.

Desde el descubrimiento del gen de la proteína prión (PrP), hace más de una década, las investigaciones transgenéticas sobre el gen PrP han delineado el campo de la biología del prión en una forma sin precedente. Muchas preguntas respecto al papel del PrP en la susceptibilidad de un organismo expuesto a priones han sido elucidadas. Por ejemplo, ratones con la eliminación del gen PrP, han permitido demostrar que un organismo que carece del gen PrP es resistente a la infección por priones. La reconstitución de estos ratones con genes mutantes PrP, ha permitido investigaciones sobre la relación estructura-actividad del gen PrP con respecto a la susceptibilidad al "scrapie". Inesperadamente, los ratones transgénicos que expresan PrP con terminaciones específicas espontáneas en la posición amino-terminal, desarrollan un síndrome neurológico presentado con ataxia y lesiones cerebelares. Un fenotipo neurológico espontáneo distinto se observó en ratones con deleciones internas en PrP. La expresión ectópica de PrP en ratones knock-out a PrP, ha sido una valiosa aproximación a la identificación de las células específicas que son capaces de replicar priones. Los ratones transgénicos también han contribuido a nuestra comprensión de las bases moleculares de la barrera de especie para priones. Finalmente, la disponibilidad de ratones knock-out a PrP y ratones transgénicos que sobreexpresan PrP, permite la reconstitución selectiva de experimentos dirigidos a la expresión de PrP en neuroinjertos o en poblaciones específicas de células hematopoyéticas. Tales estudios han arrojado resultados interesantes sobre los mecanismos de la dispersión de priones y la patogénesis de la enfermedad.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) juega un papel central en los procesos inflamatorios, incluyendo aquellos que tienen lugar en el sistema nervioso central (CNS), y ha sido implicado como un mediador patogénico, clave en algunos desórdenes humanos inflamatorios, infecciosos y autoinmunes del CNS. Usando ratones transgénicos y ratones knock-outs se ha investigado el papel de la producción alterada de TNF-alfa en el CNS. La sobreexpresión de los transgenes de tipo silvestre murino y humano del TNF-alfa por astrocitos o neuronas residentes del CNS, dispara un desorden neurológico caracterizado por ataxia, ataques y paresis, con características histopatológicas crónicas de inflamación del CNS y degeneración de la materia blanca. Además, el TNF-alfa humano transmembranal es suficiente para disparar la inflamación del CNS y la degeneración cuando se sobreexpresa por astrocitos, pero no por neuronas, indicando que las células blanco median las actividades inflamatorias del TNF-alfa localizado en la vecindad de los astrocitos más que en las neuronas. Los resultados de estos estudios muestran que ambas formas del TNF-alfa, soluble y transmembranal, pueden jugar papeles críticos in vivo en la patogénesis de la inflamación del CNS y la desmielinización.

Diseño genético de animales y metabolismo

Hablar de metabolismo es hablar de todo, y para esto aún no hemos alcanzado la máxima explotación tecnológica de las poderosas herramientas de manipulación genética, así como la explotación científica de los mutantes generados a la fecha, ya que éstas se encuentran aún en fase primordial. Es decir, la posibilidad de introducir una mutación puntual específica in vivo, en cualquier locus deseado, permitirá la producción de una segunda generación de mutantes, lo que será mucho más informativo en la disección de la función de cualquier molécula. Más aún, la posibilidad de cruzar distintos mutantes generará organismos que lleven concomitantemente "n" mutaciones en "n" loci y esto dará la posibilidad de probar y validar in vivo el papel individual de las rutas bioquímicas y celulares conocidas y desconocidas. Estas alternativas están siendo exploradas en la actualidad y nos abren nuevos campos de investigación al conocimiento científico. Como ejemplo de rutas metabólicas importantes en el organismo mencionaremos a las especies reactivas del oxígeno (ROS), las cuales han estado implicadas en la patogénesis de muchos desórdenes clínicos, tales como el síndrome distress respiratorio del adulto, el daño isquemia-reperfusión, la arteriosclerosis, las enfermedades neurodegenerativas y el cáncer. Varios modelos animales diseñados genéticamente, han sido usados como una herramienta para comprender la función de varias enzimas antioxidantes en los mecanismos de defensa celular, contra diferentes tipos de daño por agentes oxidantes. Los ratones transgénicos que sobreexpresan tres isoformas de la superóxido dismutasa, y la glutatión peroxidasa celular (GSHPx-1) en varios tejidos, muestran un aumento en la tolerancia a isquemia-reperfusión del corazón y del cerebro, hiperoxia, edema cerebral inducido por frío, adriamicina y toxicidad paracuat. Estos resultados han dado por primera vez evidencia directa que demuestra la importancia de cada una de estas enzimas antioxidantes en la protección de los animales contra el daño resultante del contacto con estos agentes, así como el efecto de un nivel aumentado de antioxidante en el mejoramiento del daño al tejido afectado. Para evaluar la naturaleza de estas enzimas en la defensa antioxidante, se han generado ratones knock outs deficientes en el gen superóxido dismutasa cobre-zinc (CuZnSOD) y GSHPx-1. Estos ratones se desarrollan normalmente y no muestran cambios patológicos significativos en condiciones fisiológicas normales. La deficiencia en estos genes no tiene efectos sobre la supervivencia del animal bajo hiperoxia. No obstante, estos ratones exhibieron una marcada susceptibilidad a toxicidad paracuat y daño a reperfusión isquémica miocárdica. Por otro lado, los ratones hembras carentes de CuZnSOD mostraron un marcado incremento en la implantación embriónica letal.

Otro ejemplo importante es el de las proteasas. Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) comprenden una familia de proteinasas relacionadas estructuralmente. Se piensa que estas proteínas juegan un papel crítico en muchos procesos patológicos y fisiológicos. La tecnología transgénica permitió determinar el papel que las MMP's tienen en estos procesos. Se desarrollaron modelos de ganancia o pérdida de función y éstos han confirmado la participación de estas proteínas en el desarrollo del enfisema pulmonar e, inesperadamente, han descubierto un mecanismo dependiente de MMP de acopio de células inflamatorias.

Fuentes de información acerca de animales transgénicos y knock outs

Una base de datos que cataloga la información sobre animales transgénicos, ha sido establecida en los Oak Ridge National Laboratories, USA, gracias a los esfuerzos del National Institute of Enviromental Health Sciences (NIEHS) en colaboración con la National Academy of Sciences Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR) y el Oak Ridge National Laboratory Human Genome Group en colaboración con John Hopkins University. Para esta base de datos computarizada (TBASE), los investigadores usaron nomenclatura estandarizada para someter la información acerca de sus líneas de animales transgénicos. En esta base se incluyen los detalles de la construcción transgénica, patrones de expresión de los transgenes, efectos morfológicos y funcionales de los transgenes, y otra información acerca de la genética, así como referencia a contactos personales e información acerca de la disponibilidad de los animales. La base de datos contiene información de fuentes publicadas y no publicadas y está disponible también a través de Internet.

Se ha publicado un compendio de mutaciones gen-específicas (ratones knock outs) y artículos relacionados en 1995 por Current Biology, Vol. 5 No. 6, 7, 8 y 9. Se describen cerca de 270 knock-out y aparecen mas de 700 publicaciones.

Una lista de unas 65 mutaciones knock-out relacionadas al sistema inmune, ha sido compilada por Fässler, R., Martin, K., Forsberg, E., Litzenburger, T. and Iglesias, A. (1995), Knock-out mice: how to make them and why. The immunological approach. Int. Arch. Allergy Immunol. 106, 323-334.. No obstante, todas estas listas, si no son actualizadas continuamente, rápidamente llegan a ser obsoletas.

El Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science publicó un número especial sobre tecnología de embriones e investigación transgénica en animales de laboratorio en 1995 (Scand. J. Lab. Animal Sci. 1995;22:No. 2).

El Jackson Laboratory Induced Mutant Resource (IMR) tiene como propósito, servir a la comunidad científica, para mantener y distribuir animales knock outs y ratones transgénicos para diferentes áreas de investigación. El IMR lleva a cabo la importación, criopreservación de embriones, y desarrollo genético (colocando la mutación en una cepa consanguínea) de las cepas aceptadas, para su distribución. El IMR publica una lista de sus cepas disponibles (actualmente son cerca de 300), la cual es actualizada periódicamente. Casi ocho nuevas cepas son añadidas mensualmente. Una lista adicional de nuevas cepas puede obtenerse mensualmente.

Las direcciones de un número de instituciones y compañías comerciales que ofrecen productos y servicios para la producción y el uso de ratones transgénicos y knock-out se listan a continuación.

Animales transgénicos: instituciones y compañías.

1. B y K Universal Ltd. , the Field Station, Grimston Aldbrough Hull, North Humberside HU11 4QE, UK. Tel: +44 1964 527 555; fax: +44 1964 527 006.
2. Bomholtfård Breeding and Research Centre, P. O. Box 39, DK-8680 Ry Denmark. Tel: +45 8684 1211; fax +45 8684 1699.
3. BRL, Wölferstrasse 4, CH-4414 Füllinsdorf, Switzerland. Tel: +41 61 9064242; fax +41 61 9012565.
4. Charles River Wiga Deutschland GmbH, Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld, Germany. Tel: +49 97 61406-0; fax +49 97615368.
5. DNX Transgenic Services, 303B College Road East, Princeton Forrestal Center, Princeton, NJ 08540, USA. Tel: +1 609 5200300; fax +1 609 5209864. (Collaboration with Chrysalis).
6. Genome Systems, Inc., 8620 Pennel Drive, St. Louis, Missouri 63114, USA. Tel: +1 315 692; fax +1 314 6920044.
7. The Jackson Laboratory Induced Mutant Resource, The Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, ME 04609-1500, USA. (Attn: IMR-3) Tel: +1 207 2883371 (main office); +1 207 2883371 (servicio a usuarios); fax +1 207 2883398.
8. Møllegaard Breeding and Research Centre A/S, Tornbjergvej 40, Ejby, DK-4623 Ll. Skensved, Denmark. Tel: +45 56 820222; fax +45 56 820274.
9. 9.k Ridge National Laboratory, Biology Division, Box 2009, Oak Ridge, TN 378 31, USA. Tel: +1 423 5743966; fax +1 423 5741271. (Attn. Richard P. Woychick).
10. Chrysalis, Les Oncins B.P. 118, 69593 l'Arbresle Cedex, France. Tel: +33 474016363; fax +33 474016399. (Collaboration with DNX).
11. Taconic Farms, Inc., Transgenic Models y Services Division, 273 Hover Avenue, Germantown, NY 12526, USA. Tel: +1 518 5375200; fax +1 518 5377287. (también ver GenPharm International).
12. Transgenic Alliance, Domaine des Oncins, 69210 Saint-Germain-sur-l'Arbresle, France. Tel: +33 474016970; fax +33 474012576.

Aspectos éticos relacionados con la manipulación genética en animales

Las cuestiones éticas conectadas con la creación de líneas de animales modificados genéticamente, siempre tienen que estar en la mente de los científicos que se dedican a hacer los diseños genéticos. Muchos de estos animales pueden desarrollar enfermedades, incluso desconocidas para el hombre. Hay que tomar en cuenta el posible sufrimiento de los animales, así como la inutilidad de obtener resultados que sólo corroborarán un conocimiento ya establecido. También no hay que olvidar los cambios ecológicos que se pueden generan al crear animales con una nueva carga genética. La comisión de los derechos de los animales está muy al tanto del tipo de investigación que se realiza con cada uno de estos seres diseñados genéticamente.

Las tecnologías de los ratones transgénicos, knock-out, knock-in, de expresión inducible o tejido específica, aún se encuentran en las etapas más iniciales de desarrollo. Estas técnicas en sus inicios, fueron consideradas consumidoras de tiempo, difíciles e ineficientes, pero en la actualidad se han vuelto fáciles y muy poderosas. Parece que este campo de la biología no tiene límites en sus potencialidades. Cada animal diseñado genéticamente contiene una riqueza inmensa de nueva información y ofrece una mejor comprensión de las interrogantes más enigmáticas que existen en muchas áreas de la biología. Estas poderosas metodologías, se están desarrollando ahora en otras especies animales, diferentes al ratón y pronto serán de uso más amplio en el área de la biomedicina. Ahora el límite será nuestra propia imaginación.

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Dirección General de Servicios de Cómputo Académico-UNAM
Ciudad Universitaria, M éxico D.F.